WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биохимии им. А.Н. Баха _

На правах рукописи

УДК 535.371:547.97:57.083.3:616.441 Жердева Виктория Вячеславовна ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ ЛАНТАНИДНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ ГОРМОНА ТИРОКСИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЕВРОПИЕВЫХ МЕТОК Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в лаборатории физической биохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор А.П. Савицкий

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор С.А. Еремин кандидат биологических наук В.В. Никандров

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росздрава

Защита состоится «29» мая 2007 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «28» апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Флуоресцентный лантанидный иммуноанализ традиционно используется для определения гормонального статуса и занимает прочное место среди других методов (РИА, ИФА). Он базируется на принципе времяразрешенной микросекундной спектроскопии, в связи с чем, получил название «флуоресцентного иммуноанализа с временным разрешением» (ФИАВР). Европиевые метки обеспечивают большую, по сравнению с ферментативными метками, точность и чувствительность. В отличие от радиоизотопных меток, они безопасны для человека и окружающей среды.

Моноклональные антитела, благодаря таким их свойствам, как химическая гомогенность, высокая аффинность, эффективно используются в клинико-лабораторной диагностике, в том числе и в ФИАВР, для определения гормонов в сыворотке крови, в сухих пятнах крови.

Тироксин - гормон щитовидной железы - отвечает за многие обменные процессы в организме. Нарушение его обмена приводит к серьезным заболеваниям. Так, врожденный гипотиреоз у детей ведет к развитию умственной отсталости - кретинизму. Для своевременной диагностики и лечения врожденного гипотиреоза во многих странах введены программы неонатального скрининга, в связи с чем, представляет интерес разработка отечественных наборов для скрининга.

Наиболее современными направлениями в области разработки биоаналитических систем являются миниатюризация формата и мультианалитные исследования с выходом на высокоэффективный скрининг. В связи с этим развитие флуоресцентного анализа в настоящее время происходит в основном в следующих направлениях: поиск новых способов (технологий) проведения иммунохимических реакций и разделения их компонентов, разработка новых методов детекции и обработки флуоресцентного сигнала, поиск новых высокочувствительных маркеров, в том числе на основе лантанидных хелатов и наночастиц. Поэтому актуальны разработка иммуноанализа для определения тироксина и изучение возможности использования новых европиевых меток для этих целей.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - разработка лантанидного иммунофлуоресцентного анализа для определения гормона тироксина с использованием моноклональных антител к тироксину и европиевых меток, сопоставление разных меток в выбранной схеме иммуноанализа.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

получить моноклональные антитела к тироксину с высокой степенью аффинности и специфичности, охарактеризовать полученные мАт;

выбрать наиболее чувствительную схему диссоциативного лантанидного иммуноанализа для определения общего тироксина (Т4) в сухих пятнах крови;

изучить свойства новой флуоресцентной метки (конъюгата Nгидроксисукцинимидного эфира диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПА) и аминобензоилтритфторацетона (АБТФА)) и разработать недиссоциативный метод анализа с ее использованием для определения Т4;

разработать недиссоциативный метод анализа тироксина с использованием латексных наночастиц, содержащих европий - -дикетонатный комплекс.

Научная новизна. Разработан трифункциональный хелат, по чувствительности не уступающий бифункциональным хелатам, используемым в диссоциативных схемах. Разработаны методы получения коньюгатов с новой флуоресцентной меткой на основе N-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА и изучены их флуоресцентные свойства. Впервые продемонстрировано использование латексных наночастиц, содержащих европий, в конкурентных схемах иммуноанализа.

Практическая значимость работы. Разработан диссоциативный флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением для определения общего тироксина в сухих пятнах крови для целей неонатального скрининга.

Разработаны методы недиссоциативного ФИАВР с использованием новой флуоресцентной метки (конъюгата N-гидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА) и латексных европиевых наночастиц. Показано использование новой высокочувствительной недиссоциативной европиевой метки (конъюгата Nгидроксисукцинимидного эфира ДТПА и АБТФА) и европиевых наночастиц для определения тироксина с целью повышения предела детекции его в анализе.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: Российская школа-конференция молодых ученых «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 28 мая-июня 2000г.), I Московский Международный Конгресс «Биотехнология:

состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 октября 2002г.), III Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 14-18 марта 2005г.).

В 2002 году автору было присуждено III место в ежегодном Конкурсе на лучшую научную работу Института биохимии им. А.Н.Баха.

Часть результатов, полученных в ходе работы, была применена в 20002001г.г. при выполнении межведомственной научно-технической программы «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» по договору № 02.03.118 "Разработка иммунофлуоресцентных методов с временным разрешением для определения гормона тироксина".

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в ведущих российских журналах, 2 статьи в российском и иностранном сборниках, 3 тезиса в материалах международных и российских научных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 246 ссылок.

Работа изложена на 168 страницах, содержит 31 рисунок и 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы и объекты исследования.

Трифторацетильное производное тироксина, конъюгат тироксина с ДТПА (T4- ДТПА), а также N-гидроксисукцинимидный эфир конъюгата парааминобензоилтрифторацетона с диэтилентриаминпентауксусой кислотой (NГСИЭ-ДТПА-АБТФА) были получены к.х.н., с.н.с. А.В.Чудиновым (Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта).

В работе использовали наночастицы с включенными европий - дикетонатными комплексами (Seradyn, США), усиливающий раствор «DELFIA® Enhancement Solution», «Eu-labelling reagent» (N1 –(pизотиоцианотофенил)-диэтилентриамин- N1 N2 N3 N3тетраацетата европия (ИТЦДТТА-Eu) (Wallac Oy, Финляндия), салицилат натрия, L-тироксин, Dтироксин, 3, 3', 5-трийодо-L-тиронин, 3, 5- дийодо-L-тиронин, 3, 5-дийодо-Lтирозин, 3-йодо-L-тирозин, D-фенилгидантоин (ICN Biomedicals Inc., США).

Методы Синтез конъюгатов Конъюгаты белковых носителей с тироксином и конъюгаты европиевых наночастиц со стрептавидином получали методом активированных эфирных производных.

Синтез конъюгатов белков с производными полиаминополикарбоновых кислот производили в 0.1.М карбонатном буфере в присутствии диметилформамида на льду с последующей очисткой методом гель-фильтрации на комбинированных носителях.

Мечение антител биотином производили по восстановленным дисульфидным группам иммуноглобулинов с использованием малеимидного производного биотина с последующей очисткой на обессоливающей колонке.

Получение моноклональных антител (мАт) и их характеристика Иммунизацию мышей линии BALB/c проводили конъюгатами тироксина с бычьим сывороточным альбумином (Т4-БСА) и соевым ингибитором трипсина (Т4-СИТ). Для слияния антителопродуцирующих клеток с клетками миеломы sp2/0 использовали 50%-ный раствор полиэтиленгликоля с молекулярным весом 6 000, содержащий 10%-ный диметилсульфоксид. Отбор специфических клонов осуществляли в два этапа в иммуноферментном анализе (ИФА). Для проведения экспериментов по специфичности и по определению физико-химических характеристик моноклональных антител (мАт), а также для разработки флуоресцентного иммуноанализа использовались антитела, очищенные методом аффинной хроматографии в ступенчатом градиенте рН 2.8, 4.0, 5.0.

Определение Т4 в диссоциативном ФИАВР в схеме с меченым антигеном (Т4-ДТПА-Eu) в буфере и сухих пятнах крови Лунки полистирольного микропланшета с адсорбированными кроличьими антимышиными иммуноглобулинами (RAM) заполняли буфером для предынкубации и инкубировали на шейкере 15 минут, далее отмывали буфером для отмывки. Добавляли различные концентрации тироксина в буфере от (0 нМ до 500нМ) или выбивали по одному диску диаметром 3мм в лунку из калибровочных проб (см. ниже). В каждую лунку добавляли по 0,05 мл буфера для анализа инкубировали 1 ч на шейкере при комнатной температуре, далее добавляли по 0,05 мл буфера для анализа с выбранной концентрацией мАт и Т4ДТПА-Eu и инкубировали 1,5 часа при комнатной температуре. Удаляли диски, промывали лунки буфером для отмывки, десорбировали европий в в усиливающий раствор и через 15 мин измеряли флуоресцентный сигнал.

Для приготовления контрольных и калибровочных проб Т 4 в сухих пятнах крови использовали отмытые эритроциты группы III Rh+. Отмытые эритроциты восстанавливали 6% раствором бычьего сывороточного альбумина, до гематокрита цельной крови (52%). По полученной после центрифугирования сыворотке устанавливалось “нулевое” значение концентрации Т 4 в крови, которое определяли по уровню флуоресцентного сигнала в конкурентном ФИАВР. В восстановленную таким образом кровь добавляли Т 4 для получения конечной концентрации его в крови 300, 150, 100, 50, 20, 0 нМ и наносили на бумагу Shleiher&Schull 2992.

Определение Т4 в схеме с иммобилизованным антигеном (Т4-БСА) с разными европиевыми метками Диссоциативный с мАт-ИТЦДТТА-Eu и недиссоциативный с мАт- ДТПА-АБТФА-Eu ФИАВР В лунки полистирольного микропланшета с адсорбированным в концентрации 0.33 мкг/мл конъюгатом T4 - БСА добавляли 50 мкл T4 стандартов и 50 мкл меченных мАт в конечной концентрации 2.мкг/мл. После 1.5 ч инкубации при температуре +370С на шейкере лунки промывали буфером для отмывки. В недиссоциативном анализе флуоресценцию измеряли с поверхности дна осушенных лунок. В диссоциативном анализе добавляли по 150 мкл усиливающего раствора, после 15- минутной инкубации на шейкере измеряли флуоресценцию.

Недиссоциативный ФИАВР с наночастицами В лунки полистирольного микропланшета с адсорбированным конъюгатом T4 -БСА добавляли по 10 мкл T4 стандартов (0.01 - 100нМ), и по 40 мкл буфера для анализа, содержащего мАт, и инкубировали 2,5 часа при комнатной температуре. Далее промывали лунки буфером для отмывки, добавляли конъюгат стрептавидина с наночастицами. После 2 часов инкубации лунки планшета промывали буфером для отмывки и считывали флуоресцентный сигнал с поверхности дна лунок.

Параметры регистрации флуоресценции: время задержки 0.1 мс, частота вспышки 1 мс, время считывания сигнала 0.4 мс, возбуждение на 340 нм и регистрация флуоресценции на 613 нм.

Предел детекции (ПД) аналита во всех случаях рассчитывали как среднее значение нулевой концентрации плюс два стандартных отклонения (СР.

ЗНАЧ. +2 СТ. ОТКЛ.).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. ХАРАКТЕРИСТИКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Были отобраны 3 клона моноклональных антител, синтезирующих антитела к тироксину, наиболее устойчивые и жизнеспособные в культуре:

6Е6Е5, 7F3G12, 7F3G5. Для определения аффинных констант был использован метод, описанный Friguet, 1985. Каждое из исследованных мАт давало прямую на графике Скетчарда, что свидетельствовало о гомогенности антигенсвязывающих центров антител. Значения констант диссоциации приведены в табл.1.

Таблица 1.Основные характеристики моноклональных антител.

Название клона класс/подкласс Константы диссоциации, М 6E6E5 IgG1 1,0E-7F3G12 IgG2b 1,7E-7F3G5 IgG2b 2,5E-Таблица 2. Перекрестная реактивность мАт (на 50% связывания).

Перекрестные реагенты 6E6E5 7F3G5 7F3GL-тироксин 100% 100% 100% D-тироксин 100% 100% 100% 3,3',5-трийодо-L-тиронин 2% 1% 1% 3,5-дийодо-L-тиронин 0% 0% 0% 3,5-дийодо-L-тирозин 0% 0% 0% 3-йодо-L-тирозин 0% 0% 0% D-фенилгидантоин 0% 0% 0% Кросс-реактивность оценивали как отношение концентрации тироксина и концентрации перекрестно реагирующего лиганда, при которой происходит ингибирование связывания тироксина c моноклональными антителами на 50% в ИФА (табл.2). Как видно из таблицы, антитела специфичны исключительно к гормону Т4, перекрестная реактивность на трийодтиронин составляет не более 1-2%. Физиологическая концентрация Т3 примерно в 4 раза ниже концентрации Т4, поэтому ошибка минимизируется до 0.2-0.5%. 100% чувствительность антител к D-тироксину можно объяснить тем, что у молекулы Т4 погружена в центр связывания антител только ароматическая часть и не погружен хиральный центр, С углерод, относительное положение заместителей которого и определяет тип стереоизомера. Для разработки иммунофлуоресцентного анализа были выбраны мАт 6Е6Е5 по таким показателям: а) стабильный и устойчивый рост гибридомы; б) неизменность иммунологической активности при длительном хранении. Было установлено, что при хранении аффинно очищенных антител в морозильной камере при –20 0С не наблюдается падение титра для 6Е6Е5 в течение восьми месяцев.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»