WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Образование продукта ГБТ/Атр происходило как в водном растворе, так и в органическом растворителе – метаноле. Известно, что ГБТ в водных растворах может переходить в ионную форму. Поэтому было сделано предположение, что могут образовываться два продукта, в структуру которых входят и ГБГ и атразин с образованием связи (–N–O–C–) в положении (2) атразина. Предполагаемая схема происходящих реакций приведена на рис. 6.

HN C CH H N N ГБТ Атр N CH N N N C CH H H HN C CH N N H N N N + O CH N Cl N N C CH H H OH HN C CH H N N CH H N N C CH H H N N N + N N + N O - O Рисунок 6. Предполагаемая схема реакций в модельной системе, содержащей атразин и ГБТ Внесение лакказы в раствор ГБТ/Атр приводило к образованию ряда продуктов, причем один из них по времени удерживания соответствовал соединению ГБТ–Атр (рис. 7).

В ферментативной реакции образовались два других продукта, которые имели времена удерживания 15,3 мин и 19,4 мин. Сравнение со стандартами показало, что продукт со временем удерживания 15,3 мин соответствует деэтилатразину (ДЭА). Продукт со временем удерживания 19,4 мин может соответствовать соединению, образующемуся при взаимодействии ДЭА и ГБТ (рис. 8). Таким образом, добавление фермента приводило к образованию новых продуктов, отличных от продукта, образующегося в реакции ГБТ с атразином.

0,23,0,0,0,Атр 20,AU 0,0,0, 19,0,15,0,2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,Мин Рисунок 7. Хроматограмма водного раствора Атр/ГБТ/лакказа;

соотношение Атр/ГБТ 1/1; концентрации исходных реагентов: Атр – µМ, ГБТ – 100 µМ; температура – 25°С; время инкубации – 7 суток NHN N N N N ГБТ Атр O H N CHN C H H CHCl N N + N N N NHN + N N + N N - HN N NH N O CH C2H5 - HN H3C O H CHC CHH3C N Cl N N N N OH HN N NHCH H3C CHРисунок 8. Предполагаемая схема взаимодействия Атр/ГБТ/лакказа и продукты, образующиеся в реакции Исследование модельной системы «атразин/лакказа/ГБТ» проводили при различном мольном соотношении «атразин/медиатор» (от 9/1 до 1/9) и при двух концентрациях фермента (0,02 µМ и 1,0 µМ).

Было установлено, что убыль атразина возрастала с увеличением концентрации медиатора. Уже при соотношении ГБТ/Атр 1/1 убыль атразина переходила 10%–ный порог. В то же время при соотношении ГБТ/Атр, равном 9/1, и концентрации фермента 0,02 µМ наблюдалось максимальное уменьшение атразина – до 70% за 10 суток (табл. 4). Для высокой концентрации фермента – 1,0 µМ – эффективность деструкции атразина была существенно ниже, составляя 28% за 10 суток (см. табл. 4).

Теоретически более высокая концентрация фермента должна приводить к увеличению степени деградации атразина. При увеличении содержания фермента возрастает количество ГБТ, взаимодействующего с лакказой с образованием не только высокореакционноспособного промежуточного продукта, но и выводящегося из сферы реакции конечного продукта. Вероятно, данный процесс снижает концентрацию ГБТ и, соответственно, концентрацию комплекса ГБТ–атразин. По этой причине высокая концентрация фермента не позволяет увеличить степень деструкции атразина.

Таблица 4. Результаты ВЭЖХ модельных смесей «атразин/ГБТ/лакказа» № ГБТ, Атра– Фер– ГБТ/ Убыль атразина, % µМ зин, мент, Атр 4 сут 7 сут 10 сут µМ µМ 1 11,5 103,6 1,0 1/9 1,8 2,1 4,2 16,4 98,6 1,0 1/6 2,3 3,4 4,3 28,7 86,3 1,0 1/3 1,8 5,0 4,4 57,3 57,5 1,0 1 7,1 6,9 17,5 86,0 28,8 1,0 3 15,6 19,8 28,6 98,3 16,4 1,0 6 18,7 26,3 28,7 103,2 11,5 1,0 9 24,0 23,6 27,Конт– 0 57,5 0 – 0 0 роль Конт– 0 57,5 1,0 – 0 0 роль 1 11,5 103,6 0,02 1/9 4,5 5,1 5,2 16,4 98,6 0,02 1/6 5,1 6,7 5,3 28,7 86,3 0,02 1/3 4,6 4,1 5,4 57,3 57,5 0,02 1 20,0 40,2 47,5 86,0 28,8 0,02 3 33,8 40,0 52,6 98,3 16,4 0,02 6 40,2 49,3 62,7 103,2 11,5 0,02 9 57,5 69,3 72,Конт– 0 57,5 0 – 0 0 роль Конт– 0 57,5 0,02 – 0 0 роль Использование метода протонного ядерного магнитного резонанса (1H–ЯМР) позволило подтвердить образование продуктов в модельных системах «Атр/ГБТ» и «Атр/ГБТ/лакказа».

Подсчет протонов атразина в смеси «Атр/лакказа» подтвердил данные ВЭЖХ о том, что лакказа не окисляет атразин. Т.к. реакционные смеси содержали много примесных пиков в области от 5,5 до 0 ppm, сравнение спектров проводили по ароматической области от 8,1 до 7,ppm, отличающейся чистотой спектра.

Спектры ГБТ и смеси «ГБТ/лакказа» показали изменение структуры ГБТ при воздействии фермента (рис. 9). При этом структура продукта менялась с течением времени, т.е. фактически шел распад ГБТ.

В системах «Атр/ГБТ» и «Атр/ГБТ/лакказа» шло образование одинаковых продуктов (соединение Атр–ГБТ), но при этом в области 7,55–7,4 ppm в системе «Атр/ГБТ/лакказа» происходило небольшое смещение по сравнению с «Атр/ГБТ» (см. рис. 9). Это может говорить об образовании еще одного продукта, подобного соединению Атр–ГБТ.

Данные ВЭЖХ говорят о том, что этим продуктом является ДЭА–ГБТ.

Рисунок 9. Спектры H–ЯМР систем «ГБТ/лакказа», «Атр/ГБТ» и «Атр/ГБТ/лакказа» Для установления структуры предполагаемых продуктов был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии– тандемной масспектрометрии (ВЭЖХ–МС–МС). Полученные данные подтвердили наше предположение об образовании соединения в системе «Атр/ГБТ» (рис. 10, А) и об образовании ДЭА и соединения ДЭА–ГБТ в системе «Атр/ГБТ/лакказа» (рис. 10, Б).

А CHH2C HN H N HN N N N C N + N CH3 + N H + N 2 H N N ( ) ) ( N H O CHN N C - HN H O H CHC CHH3C Б NHNHCl N N N N N N N N + + N 2H H CH3 H ( O N ) ( N N H ) CHN HN N NHC N C H H + N CHCH3 H3C CH N CHO Рисунок 10. А – продукты, образующиеся в системе «Атр/ГБТ»; Б – продукты, образующиеся в системе «Атр/ГБТ/лакказа» В реакции атразина с ГБТ образуется продукт с молекулярной массой 314 г/моль. Он может существовать в двух формах:

протонированной с м.м. 315г/моль и дипротонированной с м.м. 316 г/моль (см. рис. 10, А). В реакции «Атр/ГБТ/лакказа» образуется ДЭА (см.

рис.10, Б), протонированная (м.м. 287 г/моль) и дипротонированная (м.м.

288 г/моль) формы продукта ДЭА–ГБТ (см. рис. 10, Б).

Базируясь на полученных данных о пяти установленных структурах продуктов, мы предложили схему окисления атразина системой «лакказа/ГБТ» (рис. 11), которая включает неферментативную и ферментативную стадии (рис. 12). На неферментативной стадии происходит образование продукта, состоящего из атразина и ГБТ. Т.к.

исходные реагенты и продукты в системе Атр/ГБТ находятся в равновесии, введение в реакцию лакказы вызывает окисление ГБТ и образование радикала ГБТ (см. рис. 12). Радикал ГБТ реагирует с соединением Атр–ГБТ и инициирует распад связи (–NH–CH–), в результате чего образуются соединение ДЭА–ГБТ и этиловый спирт. В свою очередь соединение ДЭА–ГБТ распадается с образованием продуктов – ДЭА и ГБТ. Свойства ГБТ образовывать таутомерные формы и непосредственно реагировать с атразином позволили предположить, что ГБТ будет выведен из сферы реакции. Однако, согласно предложенной схеме, при гидролизе ДЭА–ГБТ образуются ДЭА и ГБТ. Это может быть одной из причин эффективности ГБТ в качестве редокс–медиатора лакказы.

CHH2C NHHN H N N N N N Cl N N N N N H CHN + N N O N C N N O H H N + N CH3 CHN лакказа C H O HN N NH CH3 -C2H5OH CH CH2CHH3C N NHH N CH3 N HN N N + C N N + N CHN N N N N H2N O - CH(CH3)N O HN N CH OH CHH3C N N N Cl OH N N + HN N NHCH H3C H CHN N + N OРисунок 11. Общая предполагаемая схема трансформации атразина системой лакказа/ГБТ CHH2C HN NHN N N N N N N N N N H CHH O CHN N O N C N C N H лакказа N H CHCHN N + N –C2H5OH O2 2H2O N. N H N HOH O NHN N N C N + + N CHN N N N N N H2N O HN O - CH(CH3)CH CHH3C N N Cl N OH N N + HN N NH2 H CH N H3C + CH3 N N OРисунок 12. Ферментативная стадия предложенной схемы трансформации атразина системой лакказа/ГБТ Отметим, что лакказа C.fulvocinerea не окисляла атразин в отсутствие медиатора. Из четырех выбранных медиаторов (ГБТ, сирингалдазин, [Ru(phpy)(phen)2]PF6 и [Ru(bpy)2Cl2]) реакцию инициировал только ГБТ, из чего можно сделать вывод, что в данном случае электрохимическая обратимость медиатора и высокая эффективность катализа медиатор/лакказа не являются определяющими факторами деградации. Атразин реагировал с ГБТ в отсутствие лакказы с образованием продукта Атр–ГБТ; все хлор–содержащие производные атразина также взаимодействовали с ГБТ, в отличие от гидрокси– производных атразина. Это говорит об образовании продукта посредством замещения атома хлора в положении (2) атразина. В реакции с участием лакказы образовывались продукты, отличные от продуктов в реакции «Атр/ГБТ», а именно ДЭА и ДЭА–ГБТ. Важную роль в ферментативной реакции играло соотношение «ГБТ/атразин»; рост этого соотношения вызывал увеличение деструкции атразина.

ВЫВОДЫ 1. Получены и охарактеризованы индуцибельные и конститутивные изоформы лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus. При внесении индуктора синтезируются две индуцибельные и две конститутивные формы фермента. По изоэлектрической точке, молекулярной массе, углеводному составу и термостабильности индуцибельные формы фермента незначительно отличаются от конститутивных форм фермента. Исследованные физико–химические свойства и кинетические параметры индуцибельных форм позволяют предположить их эффективное участие в процессах делигнификации и детоксификации ксенобиотиков.

2. Показана возможность деградации гербицида атразина базидиальными грибами Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea и ко-культурой Coriolus hirsutus/Cerrena maxima в условиях глубинного культивирования. Выявлена корреляция между уровнем деградации атразина и биосинтезом оксидоредуктаз (Mn–пероксидазы и лакказы).

3. Показано, что деградация атразина в модельных системах «атразин/медиатор» и «атразин/медиатор/лакказа» происходит при использовании в качестве редокс–медиатора 1–гидроксибензотриазола.

4. Установлены продукты деградации гербицида атразина в системах «атразин/1-гидроксибензотриазол» и «атразин/ 1-гидроксибензотриазол/лакказа». В системе «атразин/ 1-гидроксибензотриазол» образуются два продукта – соединение атразин– 1-гидроксибензотриазол в протонированной и дипротонированной форме;

в системе «атразин/1-гидроксибензотриазол/лакказа» идет формирование 5 основных продуктов: соединение атразин–1-гидроксибензотриазол в двух формах, соединение деэтилатразин–1-гидроксибензотриазол в протонированной и дипротонированной форме и деэтилатразин. На основании полученных данных предложен механизм деградации атразина в системе «атразин/1-гидроксибензотриазол/лакказа».

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи 1.Горбатова О.Н., Степанова Е.В., Королева О.В. Изучение некоторых биохимических и физико–химических свойств индуцибельной формы внеклеточной лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus.

Прикладная биохимия и микробиология, 2000, т. 36, №3, с.272–277.

2.Горбатова О.Н., Королева О.В., Ландесман Е.О., Степанова Е.В., Жердев А.В. Индукция биосинтеза лакказы как способ увеличения потенциала детоксификации базидиомицетами. Прикладная биохимия и микробиология, 2006, т.42, №4, с.468–474.

3.Горбатова О.Н., Жердев А.В. Королева О.В. Триазиновые пестициды: структура, действие на живые организмы, процессы деградации. Успехи биологической химии, 2006, т.46, с.323–348.

Тезисы 4.Gorbatova O., Koroleva O., Stepanova E., Landesman E., Zherdev A.

Degradation of herbicide atrazine by basidiomycetes producing extracellular laccases. Proceedings of the «First International Conference on Remediation of Contaminated Sediments». Venice, Italy, October 10–12, 2001, p. 321–324.

5.Gorbatova O.N., Koroleva O.V. The role of redox–mediators in biodegradation of herbicide atrazine by fungal laccase. Young Scientists Conference «Biotechnology for future» affiliated to the 3-rd International Symposium «EU—Russia: Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme». St. Petersburg, Russia, June 6-8, 2006, p.23–24.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»