WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

() – активность лакказы; () – активность MnП Проводилось сравнительное изучение активности лакказы для разных схем внесения индукторов при культивировании базидиомицетов C.hirsutus, C.fulvocinerea, C.maxima и C.hirsutus/C.maxima:

1) одновременное внесение атразина и индуктора (сирингалдазин или гваякол) на третьи сутки культивирования; 2) внесение атразина на третьи сутки культивирования, а индуктора – на шестые сутки культивирования.

Изменения содержания атразина, определенные методом иммуноферментного анализа (ИФА), при его трансформации грибными культурами представлены в табл. 2. За 100% принимали концентрацию внесенного атразина в среду культивирования. При внесении индукторов на 3 сутки культивирования наблюдалось наибольшее разрушение атразина по сравнению с неиндуцированными культурами (см. табл. 2).

Исключение составляет ко–культура: для нее индуцирование на 3 сутки приводило к меньшей деградации гербицида (83–87%), а индуцирование на 6 сутки – к максимальной (93–96%). Однако следует учитывать, что именно ко–культура показывала максимальную активность MnП в среде с атразином во время культивирования. Накопление MnП происходило в течение 10 суток культивирования и могло послужить причиной сдвига индукции.

При индукции на 3 сутки 50%–ное изменение концентрации атразина достигалось на 8–11 сутки культивирования, в зависимости от штамма и индуктора.

Уменьшение концентрации атразина различными культурами без индукторов составляло от 81 до 94%, а с индукторами – 77–98%.

Наименьшую остаточную концентрацию атразина (2%) показал штамм C.fulvocinerea при добавлении в среду гваякола на 3 сутки культивирования.

Таким образом, показано, что индукция на 3 сутки более эффективна, чем индукция на 6 сутки. Возможно, полупродукты распада также индуцируют синтез лакказы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что атразин стимулировал биосинтез лакказы в течение длительного времени. Учитывая некоторое уменьшение концентрации атразина при внесении в среду индукторов по сравнению с неиндуцированными культурами, можно предположить, что сирингалдазильные и гваяцильные остатки, которые являются продуктами разрушения лигнина базидиомицетами, потенциально могут осуществлять в природе функцию редокс–медиаторов. Все исследованные штаммы разрушали атразин и при этом синтезировали лакказы. В присутствии атразина процесс синтеза лакказы шел постоянно, что позволяет предположить участие этого фермента в деградации атразина. Из четырех исследованных культур наиболее эффективно деградировала атразин культура C.fulvocinerea, причем процесс сопровождался высокой лакказной активностью в среде культивирования. Поэтому данная культура была выбрана в качестве штамма – продуцента лакказы для дальнейшего изучения биодеструкции атразина в модельных системах, содержащих фермент и редокс–медиатор.

Таблица 2. Разложение атразина базидиальными грибами в присутствии индукторов при их внесении на 3 и 6 сутки культивирования Базидиомицет Индуктор Степень деструкции атразина, % 3/6 сутки культивирования 9 сутки 43 сутки ––––– 38,0 86,Coriolus Гваякол 50,0/7,0 87,5/88,hirsutus Сирингалдазин 52,0/11,0 84,0/86, ––––– 42,5 81,Cerrena maxima Гваякол 42,5/40,0 76,7/83,Сирингалдазин 65,0/15,0 82,5/78,C.hirsutus/ ––––– 55,0 82,C.maxima Гваякол 52,5/34,0 83,2/96,Сирингалдазин 57,5/37,0 86,5/93,Coriolopsis ––––– 50,0 94,fulvocinerea Гваякол 50,0/32,0 98,0/94,Сирингалдазин 42,0/34,0 94,0/90,Характеристика внеклеточной лакказы базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea 0677.

Выделение и очистка лакказы базидиомицета C.fulvocinerea включали следующие стадии: высаливание сульфатом аммония, хроматография на ДЭАЭ–вате, хроматография и рехроматография на ДЭАЭ –Toyopearl 650 M. В результате был получен гомогенный препарат фермента, а степень очистки составляла 380.

ИЭФ фермента показало, что лакказа имеет одну изоформу с ИЭТ, равной 3,5. Как и большинство лакказ, данный фермент является одноцепочечным гликопротеином, что подтверждено данными электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС – натрия. Полученная в гомогенном состоянии лакказа C.fulvocinerea имела молекулярную массу 54±2 кДа.

Согласно данным атомно–адсорбционного анализа молекула фермента содержала 4 иона меди. Сведения о наличии четырех атомов меди в исследуемой лакказе были подтверждены спектрофотометрическим методом с использованием 2,2`–бихинолина.

Оптические спектры показали характерный пик иона меди первого типа при длине волны 610 нм и плечо на 340 нм, свидетельствующие о наличии бинарного комплекса меди третьего типа.

Данные ЭПР подтвердили присутствие в исследуемом ферменте ионов меди первого типа и иона меди второго типа. Параметры иона меди первого типа для лакказы C.fulvocinerea: g=2,030 mT, g||=2,175 mT, А||=8,00х10–3 см–1. Спектры свидетельствуют о наличии четырех атомов азота в координационной сфере иона меди первого типа; значение АN составляло 1,00 mT.

Также отметим, что характеристики ионов меди аналогичны другим исследованным ферментам.

Исследуемый фермент содержал аномально высокий уровень углеводов (35%) по сравнению с другими грибными лакказами (2–20%).

Молекула лакказы содержала маннозу, галактозу, N–ацетилглюкозамин в соотношении 7,5:1:1.

Однако растительные лакказы, содержащие аналогичное количество углеводов на молекулу фермента, имели довольно высокие значения молекулярных масс (65–75 кДа). Для лакказы C.fulvocinerea молекулярная масса была достаточно низкой (54 кДа). Преобладание маннозы в составе углеводной части также не характерно для грибных лакказ. Очевидно, лакказа базидиомицета C.fulvocinerea значительно отличается по физиолого–биохимическим и молекулярно–генетическим характеристикам от других лакказ.

рН–оптимум фермента C.fulvocinerea, измеренный в 0,1 М натрий– ацетатном буфере и в универсальном буфере, лежал ближе к нейтральной области и соответствовал рН 4,5–6.

Исследование термостабильности проводилось в 0,1 М натрий– ацетатном буфере рН 4,5 при температуре 50оС. 50%–ное сохранение активности соответствовало 155 ч инкубации.

Константы Михаэлиса (Кm) были определены из зависимостей начальных скоростей ферментативной реакции от концентраций субстратов по убыли второго субстрата кислорода. Исследуемая лакказа катализировала окисление различных субстратов, включая орто– и пара– дифенолы и неорганические ионы. В ряду пирокатехин – ферроцианид калия – гваякол – гидрохинон – феруловая кислота – синаповая кислота наблюдалось уменьшение Кm от 320 до 10 µМ. При сравнении этого параметра для указанных субстратов мы видим, что наблюдаемое 30-кратное различие обусловлено химической структурой субстратов.

Полученные результаты позволяют заключить, что лакказа C.fulvocinerea имеет более нейтральный рН–оптимум (pH 4,5–6,0) по сравнению с изученной нами ранее лакказой C.hirsutus (pH 4,5). Кроме того, лакказа C.fulvocinerea является высокотермостабильным ферментом по сравнению с другими грибными лакказами (сохраняет 50% активности в течение 6 суток). Эти результаты делают перспективным использование лакказы в биотехнологических процессах, протекающих при довольно высоких температурах.

Сравнительная характеристика различных субстратов, используемых в качестве медиаторов в реакции с лакказой из базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea. В качестве редокс–медиаторов были выбраны 4 соединения: сирингалдазин, 1–гидроксибензотриазол (ГБТ), [Ru(PhPy)(Phen)2]PF6 (К1) и [Ru(Bpy)2Cl2] (К2).

Все 4 соединения являются субстратами фермента. Сирингалдазин также проявляет себя как хороший индуктор при биосинтезе фермента базидиомицетами и, возможно, является природным редокс–медиатором, образующимся in vivo. Рядом авторов показано использование ГБТ в качестве медиатора некоторых ферментативных реакций, в том числе с участием лакказы. Выбор рутениевых комплексов в качестве редокс– медиаторов был обусловлен данными о том, что комплексы рутения являются высокореакционноспособными субстратами таких оксидоредуктаз, как глюкозооксидаза и пероксидаза хрена.

Сравнение выбранных соединений проводили по электрохимическим и кинетическим параметрам.

Электрохимические измерения проводили методом циклической вольтамперометрии, определяя следующие характеристики: величины анодного и катодного токов и потенциалы восстановления и окисления этих соединений. В качестве рабочего электрода использовали стеклоуглеродный, электродом сравнения был Ag/AgCl, вспомогательным – платиновый электрод.

Циклическая вольтамперометрия рутениевого комплекса Кпоказала пик восстановления –115 мВ и пик окисления +163 мВ (рис. 4, А). Рассчитанный потенциал средней точки (Eср.т.) между потенциалами катодного и анодного пиков составляет 24 мВ.

Рутениевый комплекс К2 имеет пик восстановления +390 мВ и пик окисления +494 (рис. 4, Б). Таким образом, потенциал средней точки Eср.т.

равен 442 мВ.

Циклическая вольтамперометрия сирингаладзина дала пик восстановления +372 мВ и пик окисления +431 мВ (рис. 4, В). Потенциал средней точки равен 402 мВ.

На вольтамперограмме ГБТ наблюдается один пик окисления при +885 мВ (рис. 4, Г). Потенциал полуволны равен 789 мВ. Циклическая вольтамперометрия ГБТ говорит о том, что происходит окисление ГБТ в результате необратимой реакции.

Рисунок 4. Циклические вольтамперограммы исследуемых соединений.

А – [Ru(phpy)(phen)2]PF6 (26 µM) V – 20 мВ/сек; Б – [Ru(bpy)2Cl2] (500µM) V – 40 мВ/сек; В – сирингалдазин (193 µМ) V – 20 мВ/сек; Г – ГБТ (350 µМ) V – 10 мВ/сек. V – скорость записи циклических вольтамперограмм. Все вольтамперограммы были записаны в 0,1 М натрий–ацетатном буфере рН 4,5.

Сформулированные требования к редокс–медиаторам ферментов, в частности лакказ, включают в качестве ключевого параметра способность редокс–медиатора окисляться ферментом и существовать в устойчивой форме значительный промежуток времени. Таким образом, необходимым (однако не всегда достаточным) условием использования химического соединения в качестве редокс–медиатора является его способность вступать в реакцию с ферментом, т.е. соединение должно быть субстратом фермента.

При исследовании кинетики окисления комплексов [Ru(phpy)(phen)2]PF6 и [Ru(bpy)2Cl2] по зависимости начальных скоростей реакции от концентрации комплекса наблюдалась тенденция к выходу на плато, т.е. получалась кривая насыщения. Можно предположить, что окисление комплексов рутения в присутствии лакказы происходит с образованием фермент–субстратного комплекса, а не просто в результате аутосферного переноса электрона. По этой причине экспериментальные данные для комплексов рутения также были обработаны, исходя из схемы Михаэлиса–Ментен.

Кинетические параметры окисления исследованных субстратов лакказой из C.fulvocinerea были определены спектрофотометрически по накоплению продукта для К1, К2 и сирингалдазина. Кинетические параметры окисления ГБТ определяли по поглощению кислорода, используя электрод Кларка. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Таблица 3. Кинетические параметры окисления субстратов в присутствии лакказы (0,1 М натрий–ацетатный буфер рН 4,5, 25С) Субстрат Km, Kcat, Kcat/ Km, Eср.т., Реакционная µМ с–1 M–1•c–1 мВ способность (в порядке убывания) [Ru(phpy)(phen)2]PF6 (К1) 8,8 32700 24 3,Сирингалдазин 11 205 402 1,[Ru(bpy)2Cl2] (К2) 56 186 442 3,Гидроксибензотриазол* 290 0,18 789 6,* Для К1, К2 и сирингалдазина потенциал рассчитывался как потенциал средней точки Еср.т = (Ек + Еа)/2. Для ГБТ потенциал рассчитывался как потенциал полуволны.

Рассмотренные соединения по эффективности катализа лакказой из C.fulvocenerea можно распределить в следующем порядке (по убыванию эффективности катализа): [Ru(phpy)(phen)2]PF6 > сирингалдазин > [Ru(bpy)2(Cl)2] > 1–гидроксибензотриазол. Таким образом, комплекс Кимеет более высокое сродство к лакказе, чем ГБТ. При этом, как видно из табл. 3, кинетические параметры выбранных соединений зависят от потенциалов этих соединений: чем потенциал ниже, тем выше эффективность катализа, что согласуется с данными других авторов.

Анализируя полученные данные, можно сделать предположение, что медитор должен являться хорошим субстратом лакказы, быть электрохимически обратимым соединением и иметь значительное время жизни. Рутениевый комплекс К1 обладает наиболее перспективными характеристиками в качестве редокс–медиатора лакказы, удовлетворяя всем этим требованиям.

Исследование трансформации атразина в модельных системах, содержащих лакказу C.fulvocenerea и редокс–медиатор. Сравнительное исследование свойств редокс–медиаторов проводили в системе «атразин/лакказа/редокс–медиатор».

Для изучения трансформации атразина системой, содержащей фермент и редокс–медиатор, использовали метод ВЭЖХ, позволяющий исследовать как убыль атразина, так и накопление продуктов.

Основные продукты, которые детектировались в контрольных системах «медиатор», «медиатор/лакказа» и «атразин/медиатор», при выбранных условиях проведения анализа отличались по времени удерживания от атразина и его производных. Это позволило достоверно определять продукты взаимодействия лакказы с медиаторами и атразином.

23,1,1,0,AU 0,0,Атр 20,0,0,2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,Мин Рисунок 5. Хроматограмма водного раствора ГБТ/Атр; соотношение ГБТ/Атр 1/1; концентрации исходных реагентов: Атр – 100 µМ, ГБТ – µМ; температура – 25°С; время инкубации – 7 суток Показано, что в контрольных образцах «атразин/лакказа» и «атразин» (водный раствор) изменений концентрации атразина не происходило в течение всего времени эксперимента (10 суток), т.е.

лакказа C.fulvocinerea не вступала в реакцию с атразином. Следует отметить, что из-за длительности анализа эксперимент проводился в стерильных условиях.

При исследовании трансформации атразина в модельных системах, содержащих лакказу, было установлено, что из четырех выбранных соединений (сирингалдазин, ГБТ, К1 и К2) только ГБТ вызывал убыль атразина.

Более детальное исследование компонентов модельной системы «атразин/лакказа/ГБТ» показало, что сам ГБТ реагировал непосредственно без участия лакказы с атразином и другими хлор– содержащими производными атразина (рис. 5) и не взаимодействовал с гидрокси–производными атразина. Это позволило предположить, что реакция ГБТ с атразином идет путем замещения атома хлора в положении (2) атразина.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»