WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Горбатова Ольга Николаевна ДЕГРАДАЦИЯ ГЕРБИЦИДА АТРАЗИНА БАЗИДИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ И ИХ ФЕРМЕНТАМИ Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в группе «Ферментативные основы биодеградации» Института биохимии имени А.Н.Баха РАН Научные руководители: доктор биологических наук О.В. Королева кандидат биологических наук А.В.Жердев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Т.А. Валуева доктор химических наук, профессор С.А.Еремин

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН

Защита состоится «29» мая 2007 г. в 11.00 на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу:

119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «28» апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Деградация ксенобиотиков в природе является процессом, интенсивное изучение которого вызвано, прежде всего, потребностями экологической безопасности. В свете современных представлений изучение деградации ксенобиотиков, в частности пестицидов, следует проводить с учетом состава микрофлоры, имеющей непосредственный контакт с данным пестицидом в процессе его метаболизма в цепи: растение – почва – воды (в том числе грунтовые).

Особое внимание должно быть уделено поверхностному слою почвы с растительными остатками, который в качестве одного из ключевых компонентов микробного сообщества содержит базидиомицеты. В ряде работ показан высокий потенциал базидиальных грибов как эффективных деструкторов ксенобиотиков, в том числе пестицидов.

Гербицид атразин и продукты его метаболизма обнаруживаются в биогеоценозах многих стран и различных природных зон. Мировое производство атразина составляет около 500 т/год. Однако поскольку триазиновые гербициды на сегодняшний день продолжают оставаться неотъемлемой частью сельскохозяйственных технологий, то речь идет не об отказе от них, а о выборе оптимальных стратегий трансформации и удаления из окружающей среды.

Существующие на сегодняшний день данные говорят о том, что ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз, участвуют в детоксификации многих пестицидов, в том числе атразина. В настоящее время показана возможность детоксификации ряда ксенобиотиков системами, содержащими лакказы или Mn–пероксидазы в присутствии редокс–медиаторов. Редокс–медиаторами являются соединения, которые в процессе окисления ферментом образуют высокореакционные продукты. В результате использования систем фермент/медиатор на лабораторном уровне разработаны технологии детоксификации хлорфенолов, полициклических углеводородов и некоторых других соединений.

Учитывая вышеизложенное, остро стоит вопрос о новых биотехнологических методах для деструкции пестицидов, в том числе атразина. Использование системы детоксификации на основе лакказы является перспективным направлением в разработке таких методов, а эффективное использование фермента в биотехнологических процессах должно базироваться на данных о его структурной организации и механизме действия.

Цель работы и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение деградации гербицида атразина базидиальными грибами и их ферментами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное исследование индуцибельных и конститутивных форм грибных лакказ на примере лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus;

2. Изучить деградацию атразина базидиальными грибами в отсутствие и в присутствии индукторов биосинтеза лакказ;

3. Охарактеризовать лакказу базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea, обладающего самым высоким детоксификационным потенциалом в отношении атразина;

4. Исследовать системы «атразин/лакказа/редокс–медиатор» и установить структуры продуктов трансформации атразина;

5. Установить механизм окисления атразина лакказой в присутствии редокс–медиатора.

Научная новизна. Впервые охарактеризованы индуцибельные формы лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus, их биохимические и физико–химические свойства в сравнении с конститутивными изоформами лакказы C.hirsutus и другими грибными лакказами.

На примере модельного ксенобиотика атразина изучен процесс биодеградации ксенобиотиков базидиальными грибами. Исследовано влияние индукторов биосинтеза лакказы (сирингалдазин и гваякол) на деградацию гербицида атразина при глубинном культивировании базидиальных грибов. Показано, что индукторы не играют значимой роли в процессе биодеградации гербицида. Установлена ключевая роль лакказы в деградации атразина in vivo.

Изучено влияние редокс–медиаторов на окисление атразина лакказой в модельных системах. Показано, что лакказа в отсутствие редокс–медиатора не окисляет атразин и что процесс окисления атразина инициируется 1–гидроксибензотриазолом.

Установлены продукты деградации атразина в системе атразин/медиатор/лакказа и предложен механизм данного процесса.

Практическая ценность работы. Впервые установлена способность базидиальной лакказы деструктурировать триазиновый гербицид атразин в присутствии редокс–медиатора. Это позволяет использовать данный фермент в процессах детоксификации структурно близких ксенобиотиков. Предложенный механизм действия системы «лакказа–редокс–медиатор» может способствовать разработке новых систем детоксификации и биоремедиации. Полученные данные о редокс– медиаторных свойствах субстратов лакказы обеспечивают целенаправленный поиск новых редокс–медиаторов фермента.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научных конференциях: «First International Conference on Remediation of Contaminated Sediments» (Italy, Venice, 2001); Young Scientists Conference «Biotechnology for future» affiliated to the 3-rd International Symposium «EU—Russia: Prospects for Cooperation in Biotechnology in the Seventh Framework Programme» (Russia, St. Petersburg, 2006).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи и один обзор в российских журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 145 страницах. Список цитируемой литературы включает наименований. Иллюстративный материал содержит 45 рисунков и таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Индуцибельные и конститутивные изоформы лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus. Известно, что при росте базидиальных грибов на природных субстратах продукты деградации выступают в качестве индукторов биосинтеза ферментов, в частности лакказ, которые могут принимать участие в детоксификации. Данные скрининга коллекции базидиомицетов по продукции лигнолитических ферментов показали наличие нескольких штаммов, обладающих лакказной активностью. Из этих штаммов для настоящего исследования был выбран штамм Coriolus hirsutus, уровень биосинтеза лакказы которого значительно превышал аналогичный показатель для других штаммов.

Целью этого исследования являлось получение гомогенных препаратов индуцибельных изоформ лакказы гриба C.hirsutus и сравнение их биохимических и физико–химических свойств с конститутивными изоформами лакказы C.hirsutus и другими грибными лакказами. В качестве индуктора биосинтеза фермента использовали сирингалдазин.

Выделение и очистку форм лакказы проводили по стандартной методике, заключительным этапом которой было изоэлектрофоретическое разделение ферментных препаратов.

В результате были выделены два гомогенных препарата конститутивных форм лакказы: C1 (80–82%) с изоэлектрической точкой (ИЭТ) 4,0 и C2 (18–20%) с ИЭТ 4,5, и два гомогенных препарата индуцибельных форм фермента: I1 с ИЭТ 3,5 и I2 с ИЭТ 4,2, в соотношении по белку примерно 1:1.

Методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях было определено, что все четыре изоформы в гомогенном состоянии представляют собой одноцепочечные гликопротеины.

Молекулярные массы (м.м.) исследуемых изоформ, определенные методом гель–фильтрации, лежали в пределах 55–69 кДа, что согласуется с данными для других грибных лакказ.

Углеводный состав изоформ был представлен маннозой, N–ацетилглюкозамином, N–ацетилглюкозой и галактозой и варьировал от 1 до 12%. Следует отметить, что корреляции между содержанием углеводов и молекулярной массой изоформ не наблюдалось. Высказанное рядом авторов предположение о стабилизирующей роли углеводной части фермента не подтверждается полученными данными: для I2 (содержание углеводов 2%) период полуинактивации фермента (1/2) составлял 3 суток, а для I1 (содержание углеводов 7,2%) – 1 сутки.

Были определены кинетические параметры изоформ лакказы для сирингалдазина и пирокатехина. Константы Михаэлиса (Km) исследованных изоформ лежали в микромолярном диапазоне, свидетельствуя о высокой эффективности катализа. Сравнительная характеристика изоформ приведена в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительная характеристика биохимических и физико– химических свойств конститутивных и индуцибельных форм лакказ (C1, C2, I1, I2) из базидиомицета C.hirsutus.

Изо– pI м.м., Угле– рН– Т–опти– Кm, Кm, 1/2, формы кДа воды, опти– мум, С µМ µМ сут сирин– пиро– фермен– % мум галда– катехин та зин C1 4,0 55 12,0 4,5 50 1,5 118 C2 4,5 67 1,0 4,4 50 2,0 42 I1 3,5 69 7,2 4,4 50 1,0 162 I2 4,2 65 2,0 4,5 50 3,0 24 Таким образом, по исследованным биохимическим и физико– химическим свойствам (ИЭТ, м.м., углеводный состав и термостабильность) индуцибельные изоформы I1 и I2 лакказы C.hirsutus незначительно отличались от конститутивных изоформ лакказы данного вида базидиомицета. Исследованные физико–химические свойства и кинетические параметры индуцибельных форм фермента позволяют предположить его эффективное участие в процессах делигнификации и детоксификации и, в связи с этим, использовать его для решения биотехнологических задач.

Влияние индукторов на биосинтез оксидоредуктаз и деградацию атразина при глубинном культивировании базидиомицетов. Проведенное исследование влияния индукторов на биосинтез лакказы свидетельствует о целесообразности их применения при исследовании процесса биодеградации ксенобиотиков базидиальными грибами.

Было изучено влияние атразина на биосинтез оксидоредуктаз (Mn– пероксидазы и лакказы) в присутствии и отсутствие индукторов (сирингалдазин и гваякол) при глубинном культивировании базидиомицетов C.hirsutus, Cerrena maxima, Coriolopsis fulvocinerea и совместном культивировании C.hirsutus/C.maxima. Данное исследование включало оценку роли индукторов (сирингалдазин и гваякол) в процессах деградации атразина.

Активность Mn-пероксидазы (MnП) была обнаружена в трех культурах: C.maxima, C.hirsutus, и C.hirsutus/C.maxima в условиях глубинного культивирования. При росте базидиомицета C.fulvocinerea были зафиксированы лишь следовые количества активности MnП.

В культурах без атразина динамика активности MnП соответствовала характерной картине для биосинтеза лигнолитических ферментов при глубинном культивировании: постепенное увеличение, достижение максимума и последующее падение активности (рис. 1).

В присутствии атразина наблюдалась принципиально иная картина.

Активность MnП резко падала во всех трех культурах и ее уровень не превышал 10% от значений, достигаемых при культивировании в отсутствии ксенобиотика (см. рис. 1).

Динамику лакказной активности исследовали при культивировании C.hirsutus, C.maxima, C.hirsutus/C.maxima и C.fulvocinerea. Как было установлено, штамм C.fulvocinerea синтезировал при глубинном культивировании преимущественно лакказу, что позволило корректно оценить роль индивидуального фермента – лакказы в процессе деструкции атразина данным базидиомицетом.

Динамика биосинтеза лакказы в культурах C.hirsutus, C. maxima, C.hirsutus/C.maxima и C.fulvocinerea в отсутствие атразина была характерна для глубинного культивирования (рис. 2, кривая 1).

Предполагалось, что добавление атразина даст один пик активности лакказы, подобно воздействию гваякола (рис. 2, кривая 2). Однако при добавлении атразина регистрировалось несколько диффузных пиков активности фермента (рис. 2, кривые 3 и 4). Присутствие ксенобиотика стимулировало биосинтез лакказы. Наблюдался интенсивный синтез и выделение внеклеточного фермента в среду культивирования, причем на протяжении всей ферментации.

MnП, ед. Лакказа, усл.ед.

0 0 10 20 30 сут Рисунок 1. Динамика лакказной и Mn-пероксидазной активности в отсутствие и в присутствии атразина при глубинном культивировании C.maxima: 1 – Mn-пероксидазная активность в отсутствие атразина;

2 – Mn-пероксидазная активность в присутствии атразина; 3 – лакказная активность в отсутствие атразина; 4 – лакказная активность в присутствии атразина.

Рисунок 2. Динамика лакказной активности при глубинном культивировании C.hirsutus: 1 – без индукторов; 2 – в присутствии гваякола; 3 – в присутствии атразина; 4 – в присутствии гваякола и атразина За условную единицу активности лакказы (усл.ед.) принимали приращение оптической плотности в 1 мл реакционной смеси за 1 мин; за условную единицу Mn–пероксидазы (ед.) – окисление 1 µМ Mn (II) за 1 мин.

Сравнение остаточной концентрации атразина с активностью оксидоредуктаз для штаммов C.hirsutus, C.maxima, C.fulvocinerea и кокультуры C.hirsutus/C.maxima (рис. 3) показало, что профили активностей лакказы и MnП во время культивирования в присутствии атразина были похожи, но к концу культивирования активность лакказы оставалась высокой, в то время как активность MnП падала почти до нулевого уровня примерно к 30 суткам.

Рисунок 3. Динамика активности лакказы и MnП и концентрации атразина в процессе глубинного культивирования базидиальных грибов:

А – Coriolus hirsutus; Б – Cerrena maxima; В – C.hirsutus/C.maxima;

Г – C.fulvocinerea. () – остаточная концентрация атразина;

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»