WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Полученные изотермы адсорбции при внесении фермента отличались от изотерм в отсутствии последнего (рис. 8). На графиках видно, что в вариантах без внесения лакказы форма изотерм была близка к линейной. В присутствии фермента форма изотерм менялась: в начале наблюдали резкое увеличение количества адсорбированного атразина при росте его равновесной концентрации, затем интенсивность адсорбции снижалась. Сложный характер адсорбционных изотерм в данном случае свидетельствует, по-видимому, о наличии различных механизмов связывания гербицида почвами.

Форма изотерм десорбции (рис. 8) указывает на гистерезис процесса адсорбции гербицида почвами и свидетельствует о частичной обратимости адсорбции атразина как в вариантах без внесения лакказы, так и в присутствии фермента. Однако количество необратимо адсорбированного гербицида в вариантах с внесением фермента превышало таковое в вариантах без лакказы. Это указывает на увеличение силы связывания атразина при внесении лакказы.

Для численной характеристики процессов адсорбции и десорбции полученные изотермы аппроксимировали уравнением Фрейндлиха, часто используемым при описании взаимодействий ксенобиотиков с почвой:

nF Атразин = KF [Атразин] (1) адсорб где Атразинадсорб – количество адсорбированного гербицида при его равновесной концентрации [Атразин], KF – константа адсорбции Фрейндлиха, nF – показатель степени нелинейности изотермы.

Численное описание гистерезиса проводили с использованием коэффициента гистерезиса Н:

H = nFa / nFd (2) где nFa и nFd – степенные коэффициенты изотерм адсорбции и десорбции в уравнении Фрейндлиха, соответственно.

Рассчитанные коэффициенты уравнения Фрейндлиха приведены в табл. 4.

Константы адсорбции Фрейндлиха (KF) для изученных почв в вариантах без лакказы варьировались в диапазоне 0.81-5.55 (табл. 4), что хорошо согласуется с данными других авторов. Максимальное значение этого показателя было зафиксировано для чернозема, что связано, по-видимому, с самым высоким содержанием СОРГ в этой почве (табл. 2).

Внесение лакказы приводило к резкому возрастанию адсорбции атразина (табл. 4). Константы адсорбции Фрейндлиха для исследованных почв возрастали до 3.13-6.79, превышая аналогичные значения для адсорбции без лакказы. Максимальное увеличение констант было отмечено для серой лесной почвы. Для чернозема и дерново-подзолистой почвы увеличение KF было менее выражено.

Дерново-подзолистая почва Атразинадсорб, мг/кг Атразинадсорб, мг/кг б а 00.511.Серая лесная почва Атразинадсорб, мг/кг Атразинадсорб, мг/кг а б Чернозем Атразинадсорб, мг/кг а Атразинадсорб, мг/кг б 10 012 0 0.5 1 1.5 [Атразин], мг/л [Атразин], мг/л Рисунок 8. Изотермы адсорбции () и десорбции () атразина при начальной концентрации 10 мг/л на различных типах почв в отсутствии (а) и присутствии (б) лакказы.

Было установлено, что в вариантах без внесения лакказы (табл. 4) для чернозема и дерново-подзолистой почвы значения nF незначительно отличались от 1, что свидетельствует о близком к линейному характеру изотерм. При внесении лакказы наблюдали снижение значений этого показателя до 0.56-0.66 (табл. 4). Это свидетельствует о том, что процесс адсорбции атразина почвами в присутствии фермента носил более сложный характер, чем простое распределение гербицида между двумя фазами. Исключение составила серая лесная почва, для которой nF не менялся.

Таблица Параметры уравнения Фрейндлиха и коэффициенты гистерезиса адсорбционнодесорбционных изотерм для различных почв в присутствии и отсутствии лакказы Адсорбция Десорбция Почва Н Сатр., KF nF R2 KF nF Rмг/л В отсутствии лакказы 5 0.24±0.01 0.22±0.01 0.85 3.3±0.4.50±0.20 0.72±0.03 0.93 8 0.30±0.02 0.25±0.01 0.90 2.9±0.10 0.57±0.03 0.27±0.02 0.88 2.7±0.5 0.10±0.01 0.11±0.01 0.90 5.1±0.0.81±0.04 0.56±0.03 0.97 8 0.10±0.01 0.13±0.01 0.90 4.3±0.10 1.68±0.08 0.52±0.03 0.94 1.1±0.5 0.15±0.01 0.17±0.01 0.99 4.9±0.5.55±0.30 0.83±0.04 0.98 8 0.29±0.01 0.22±0.01 0.88 3.8±0.10 0.36±0.02 0.23±0.01 0.89 3.6±0.В присутствии лакказы 5 0.23±0.01 0.150±0.007 0.85 4.0±0.5.80±0.29 0.60±0.03 0.70 8 0.31±0.02 0.140±0.007 0.98 4.3±0.10 0.36±0.02 0.130±0.007 0.92 4.6±0.5 0.11±0.01 0.030±0.001 0.85 18.7±0.3.13±0.15 0.56±0.03 0.99 8 0.15±0.01 0.029±0.001 0.75 18.7±0.10 0.20±0.01 0.029±0.001 0.77 19.3±0.5 0.16±0.01 0.064±0.005 0.88 10.3±0.6.79±0.34 0.66±0.03 0.86 8 0.19±0.01 0.062±0.004 0.69 10.6±0.10 0.22±0.01 0.060±0.003 0.68 11.0±0.Серая Дерноволесная подзолистая Чернозем Серая Дерноволесная подзолистая Чернозем Расчет коэффициентов гистерезиса для вариантов без внесения лакказы показал, что характер десорбции атразина был сходным для всех исследованных почв. С увеличением начальной концентрации атразина наблюдали снижение значений коэффициентов гистерезиса Н при одновременном росте KF, свидетельствующее об усилении процесса десорбции в вариантах с высокими начальными концентрациями гербицида (табл. 4). По-видимому, это связано с неоднородностью мест адсорбции атразина на почвах. Можно предположить, что при небольших начальных концентрациях атразин занимает места с наибольшей силой связывания, а при дальнейшем увеличении начальной концентрации происходит связывание гербицида с местами, характеризующимися меньшим сродством по отношению к атразину. Поэтому десорбция гербицида в вариантах с максимальными начальными концентрациями более выражена.

В вариантах с внесением лакказы для всех почв было установлено, что значения Н значительно превышали 1 во всех исследованных концентрациях атразина. Это свидетельствует о частичной обратимости адсорбции и образовании необратимо связанного гербицида. Исключение составила серая лесная почва, где при максимальной исследованной начальной концентрации (10 мг/л) наблюдали лишь незначительный гистерезис (H = 1.1). Близость величины гистерезиса к 1 указывает на то, что практически весь адсорбированный атразин легко десорбировался с серой лесной почвы при данной концентрации атразина.

Аномальное поведение серой лесной почвы объясняется, по-видимому, характером органического вещества в этой почве. Образец серой лесной почвы характеризовался значительным количеством малоразложившейся биомассы и гуминовых веществ, обедненных ароматическими структурами по сравнению с другими почвами. Принимая во внимание, что гидрофобное взаимодействие является ведущим механизмом связывания атразина гуминовыми веществами, можно предположить, что именно относительная обедненность органического вещества серой лесной почвы ароматическими структурами является причиной практически полной обратимости адсорбции атразина этой почвой при максимальной начальной концентрации атразина.

Внесение лакказы способствовало резкому снижению количества десорбированного атразина. Увеличение коэффициента гистерезиса наблюдалось для всех исследованных начальных концентраций атразина (табл. 4). Величины гистерезиса для исследованных почв составили 4.0-28.0, что превышало значения H для адсорбции-десорбции без фермента в 2-27 раз. Максимальное влияние на увеличение Н наблюдали на серой лесной почве при вносимой концентрации атразина 10 мг/л.

Однако, в отличие от вариантов без фермента, было обнаружено, что начальная концентрация не влияла на величину коэффициента гистерезиса. Это свидетельствует, по-видимому, о том, что связывание гербицида происходит не только по механизмам физической адсорбции, а, главным образом, путем включения гербицида в структуру ГК по механизму окислительного связывания. Высказанную гипотезу подтверждает также тот факт, что в ходе проведения экспериментов нами не было установлено образования метаболитов атразина, т.е. процесс разложения гербицида отсутствовал. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности ковалентного связывания атразина с ГК почв при участии лакказы в качестве катализатора.

Основываясь на проведенных экспериментах, можно сделать вывод, что внесение лакказы способствует увеличению связывающей способности почв по отношению к гербициду атразину. При этом в присутствии фермента связывание атразина почвами происходит, вероятно, по механизму окислительного связывания, о чем свидетельствует анализ характера изотерм адсорбции и десорбции, а так же увеличение количества необратимо связанного гербицида. Таким образом, взаимодействие атразина с почвами в присутствии лакказы можно рассматривать как механизм детоксикации этого гербицида в окружающей среде.

Оценка возможности использования лакказы Coriolus hirsutus в биотехнологиях очистки почв, загрязненных атразином Полученные нами результаты экспериментов по адсорбции и десорбции атразина почвами в присутствии и отсутствии лакказы свидетельствуют о возможности окислительного связывания атразина с почвенным органическим веществом по механизму окислительного связывания при участии лакказы; при этом необходимые для протекания этого процесса редокс-медиаторы присутствуют, повидимому, непосредственно в почве. Для подтверждения этих предположений и оценки возможности использования лакказы в биотехнологиях очистки почв, загрязненных атразином, нами были проведены лабораторные вегетационные эксперименты с использованием в качестве субстрата инертного наполнителя перлита и дерново-подзолистой почвы. В первом случае мы моделировали условия деградации атразина в присутствии фермента и ГК, но при отсутствии редоксмедиаторов, а во втором – почвенные условия, где присутствуют многочисленные низкомолекулярные соединения, которые могут выступать в качестве редоксмедиаторов лакказы. Атразин вносили в дозе 0.2 мг/100 мл субстрата (20 и 2 мг/кг субстрата в экспериментах с перлитом и почвой, соответственно). Это вызывало снижение биомассы растений пшеницы до 45 и 64% от контроля. Доза внесения ГК угля составила 10 и 100 мг/кг субстрата. В качестве тест-организма использовали растения мягкой пшеницы Triticum aestivum L.

Нами было установлено, что внесение ГК угля в дозах 10 и 100 мг/кг в перлит значительно снижало токсичность атразина: биомасса растений возрастала с 45 до 77% от контроля (рис. 9). Наблюдаемый эффект объясняется связыванием атразина ГК, показанный нами ранее (рис. 7). Внесение лакказы приводило к снижению детоксицирующей способности ГК, что связано, по-видимому, с образованием комплексов лакказа-ГК и изменениями свойств ГК в присутствии фермента, такими как полимеризация или частичный гидролиз, и также подтверждает установленные нами ранее закономерности (рис. 7). Таким образом, биотесты с использованием инертного субстрата перлита подтвердили полученные результаты о том, что лакказа непосредственно не инициирует процесс окислительного связывания атразина ГК, а, наоборот, приводит к снижению адсорбции гербицида на ГК.

В условиях почвы, напротив, детоксицирующую способность ГК наблюдали только в дозе 100 мг/кг, тогда как в дозе внесения ГК 10 мг/кг положительного влияния ГК на накопление растениями пшеницы биомассы отмечено не было. Однако при внесении лакказы в небольших дозах (0.076 и 0.76 мг/кг) даже на фоне дозы внесения ГК 10 мг/кг наблюдали положительную зависимость детоксицирующего эффекта ГК при увеличении дозы лакказы. Так, при одновременном внесении ГК в дозе 10 мг/кг и лакказы в дозе 0.076 мг/кг биомасса растений возросла до 75% от контроля, а при 7.6 мг/кг – до 81%.

Следует отметить, что дальнейшее увеличение дозы внесения лакказы до 7.6 мг/кг на фоне высокой дозы внесения ГК (100 мг/кг) приводило к снижению детоксицирующего эффекта и не превышало эффекта от внесения ГК угля без фермента, что обусловлено, по-видимому, процессами взаимодействия ГК с лакказой, описанными нами выше.

а б Масса растений, % от контроля Масса растений, % от контроля 100 без лакказы лакказа, 0.076 мг/кг лакказа, 0.76 мг/кг лакказа, 7.6 мг/кг 70 без лакказы лакказа, 0.38 мг/кг лакказа, 3.8 мг/кг лакказа, 38 мг/кг 40 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 Доза внесения ГК угля, мг/кг Доза внесения ГК угля, мг/кг Рисунок 9. Влияние лакказы и ГК угля на токсичность атразина в лабораторновегетатационных экспериментах на перлите (а) и дерново-подзолистой почве (б).

Таким образом, проведенные лабораторно-вегетационные эксперименты подтверждают полученные нами ранее результаты и свидетельствуют о возможности детоксикации атразина в почвенных условиях путем его связывания с ГК по механизму окислительного связывания при участии лакказы; при этом необходимые для протекания процесса редокс-медиаторы присутствуют, по-видимому, непосредственно в почве.

ВЫВОДЫ 1. Установлено формирование ферментативно активного комплекса лакказаГК нековалентной природы. Высказано предположение об определяющей роли вандер-Вальсовых, гидрофобных, - и СН- взаимодействий.

2. Показано стабилизирующее действие ГК на ферментативную активность лакказы; установлено, что стабилизирующее действие более выражено при стрессовых (рН 6.5), чем при оптимальных (рН 5.0) для фермента условиях.

3. Исследование трансформации атразина в гомогенной системе лакказаатразин-ГК показало, что лакказа снижала уровень адсорбции гербицида ГК;

наблюдаемый эффект связан с процессами модификации ГК образованием их комплексов с лакказой.

4. Установлено, что процесс трансформации атразина в гомогенной системе лакказа-атразин-ГК-редокс-медиатор в значительной степени определяется используемым редокс-медиатором; эффективным редокс-медиатором, вызывающим 60% трансформацию гербицида в исследованной системе, является 1гидроксибензотриазол.

5. Изучена трансформация атразина в гетерогенной системе лакказа-атразиниммобилизованные ГК. Показано, что в присутствии фермента связывание атразина почвами происходит по механизму окислительного связывания, о чем свидетельствует анализ изотерм адсорбции и десорбции, а так же увеличение количества необратимо связанного гербицида.

6. Проведенные лабораторно-вегетационные эксперименты показали возможность детоксикации атразина в почвенных условиях путем его связывания с ГК по механизму окислительного связывания при участии лакказы; при этом необходимые для протекания процесса редокс-медиаторы присутствуют, повидимому, непосредственно в почве.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Davidcvik V.N., Kulikova N.A., Koroleva O.V. Laccase stabilization in the presence of coal humic acids. Proceedings of the XII Intertional Meeting of the International Humic Substances Society (IHSS) ”Humic Substances in Soil and Water Environment”, Sao-Pedro, Brazil, July 25-30, 2004, рр. 545-546.

2. Королева О.В., Н.А. Куликова, Т.Н. Алексеева, Е.В. Степанова, В.Н.

Давидчик, Е.Ю. Беляева, Е.А. Цветкова. Сравнительная характеристика грибного меланина и гуминоподобных веществ, синтезируемых Cerrena maxima 0275.

Прикладная биохимия и микробиология. 2007 г., №1.

Тезисы:

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»