WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Значительный интерес с точки зрения связывания ксенобиотиков представляет содержание илистой фракции (<0.001 мм) в почве, т.к. она имеет максимальную площадь поверхности и, следовательно, обеспечивает высокую поглотительную способность почвы. По уменьшению этого показателя образцы исследованных почв можно расположить в ряд: чернозем > серая лесная > дерново-подзолистая (табл. 3).

Ферментативной активности в отобранных образцах почв после их пробоподготовки и хранения обнаружено не было, что позволило корректно интерпретировать данные по влиянию лакказы на адсорбционно-десорбционное поведение атразина в гетерогенной модельной системе.

Влияние лакказы Coriolus hirsutus на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гомогенной среде Первым этапом данной работы являлось изучение влияния лакказы C. hirsutus на процесс взаимодействия атразина с ГК в гомогенной системе.

Взаимодействие лакказы с гуминовыми кислотами Взаимодействие лакказы с ГК изучали при двух значениях рН: 5.(оптимальное значение для проявления активности и стабильности фермента) и 6.5 (неоптимальное значение, которое можно рассматривать как стрессовый фактор для фермента) в течение 72 ч инкубации. Эксперименты проводили в 50 мМ калий-фосфатном буфере при концентрации ГК 40 мг/л. В процессе проведения периодически отбирали пробы на анализ лакказной активности, содержание белка и гель-хроматографический анализ, что позволило наблюдать за изменениями, происходящими в изучаемых системах.

Как видно из графиков, представленных на рис. 1, активность лакказы в изучаемой системе в начальный момент инкубации при рН 5.0 была в 1.6 раз больше, чем при рН 6.5. Это согласуется с ранее полученными данными по изучению рН зависимости лакказы Coriolus hirsutus в универсальном буфере.

Так как в предварительных экспериментах при инкубации лакказы в течение 72 ч при 27°С наблюдали снижение активности фермента, обусловленное его микробиологическим разложением, то при проведении дальнейших экспериментов в растворы добавляли толуол (10%) в качестве бактериостатического агента. Внесение толуола, однако, приводило к ингибированию лакказной активности на 70 и 50% при рН 5.0 и 6.5, соответственно. Описанный факт связан, вероятно, с влиянием органического растворителя толуола на конформацию белковой глобулы лакказы. Различия в оптических спектрах растворов нативной лакказы и фермента в присутствии толуола было, тем не менее, незначительным. Это может объясняться влиянием толуола только на ближайшее окружение активного центра фермента.

Активность фермента в системе толуол-ГК возрастала по сравнению с активностью лакказы при добавлении толуола как при рН 5.0, так и при рН 6.5.

При этом указанное действие ГК в стрессовых для фермента условиях (рН 6.5) было более выражено: активность лакказы при внесении ГК возрастала до исходных величин. Можно предположить, что ГК образуют мицеллоподобные структуры, способствующие повышению активности лакказы.

а б Активность лакказы, % от исходной Активность лакказы, % от исходной Лакказа Лакказа Лакказа Лакказа Лакказа Лакказа + толуол + толуол + толуол + толуол + ГК + ГК Рисунок 1. Активность лакказы в присутствии толуола и ГК при рН 5.0 (а) и рН 6.5 (б). За 100 % принимали активность фермента при рН 5.0.

На рис. 2 показана динамика лакказной активности в присутствии ГК и толуола. Повышение активности фермента в первые часы инкубации характерно практически для всех грибных лакказ. Для лакказы активация наблюдалась в течение 1-3 ч при обоих значениях рН. Однако в присутствии ГК пик активности был сдвинут, и максимум соответствовал 12 ч инкубации. Это позволило нам предположить изменение в структуре лакказы в присутствии ГК, вызванное образованием комплекса с ферментом. Следует подчеркнуть, что наблюдаемые эффекты происходили и при рН 5.0, и при рН 6.5. При этом более значительная стабилизация фермента наблюдалась при рН 6.5: 83% сохранения активности по сравнению с 55% при рН 5.0. Содержание белка в процессе экспериментов было постоянным. Таким образом, эффект стабилизации фермента ГК в присутствии толуола более выражен при неблагоприятных (неоптимальных) условиях для проявления ферментативной активности, в данном случае сдвиг рН. Это согласуется с литературными данными о проявлении биологических эффектов ГК именно при стрессовых и неблагоприятных для биоты условиях.

а б Активность лакказы, % от начальной Активность лакказы, % от начальной 150 130 110 90 70 50 30 0 20 40 60 80 0 20 40 60 Время инкубации, ч Время инкубации, ч Рисунок 2. Динамика лакказной активности в процессе инкубации с ГК (•) в присутствии толуола при рН 5.0 (а) и рН 6.5 (б). Контроль – динамика ферментативной активности в отсутствии ГК ().

Полученные данные свидетельствуют об образовании комплекса лакказы с ГК, что приводит к стабилизации фермента в течение по крайней мере 72 ч (продолжительность эксперимента). Высказанное предположение подтверждается также полученными данными по гель-хроматографии исследуемых смесей.

На рис. 3 представлены хроматограммы гомогенного препарата лакказы (сплошная линия) и ГК (пунктирная линия), на которых четко видны острые симметричные одиночные пики, что свидетельствует об отсутствие неэксклюзионных эффектов: сверхэксклюзии и специфической сорбции. Элюционный объем для ГК составлял 45.4 мл (ММ = 9.6 кД), а для лакказы 38.4 мл (ММ = 21.9 кД). Заниженное значение ММ лакказы, определенное в условиях данного эксперимента, обусловлено использованием в качестве калибровочных стандартов не глобулярных белков, а полистирол-сульфонатов, наиболее адекватно описывающих хроматографическое поведение ГК. При этом изменения элюционных профилей ГК и лакказы через 72 ч не наблюдалось, что демонстрирует стабильность исследуемых веществ в течение всего эксперимента.

а б A254 A0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 V, мл V, мл Рисунок 3. Гель-хроматограммы лакказы (сплошная линия) и ГК (пунктирная линия) при рН 5.0 (а) и рН 6.5 (б).

Гель-хроматограммы системы лакказа-ГК имели более сложный характер (рис. 4). На профиле элюции кроме первого острого пика наблюдали 2-дополнительных диффузных пика.

Как видно из графиков, представленных на рис. 4, эти профили не могут быть рассмотрены как суперпозиции профилей отдельных компонентов, т.е. ГК и лакказы (рис. 3). Кроме того, наряду с пиками, соответствующими ГК (45.4 мл) и лакказе (38.4 мл), было отмечено появление пика, элюировавшегося в объеме 19.7 мл (свободный объем колонки по голубому декстрану в данных экспериментальных условиях составлял 19.2 мл). Так как в условиях эксперимента исключены неэксклюзивные эффекты, данный пик можно интерпретировать как образующееся высокомолекулярное соединение или комплекс фермента с ГК.

а б A254 A0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 V, мл V, мл Рисунок 4. Гель-хроматограммы системы лакказа–ГК при рН 5.0 (а) и рН 6.5 (б), через 0 ч (сплошная линия), 72 ч (пунктирная) совместной инкубации.

Кроме пика на 19.7 мл было показано также образование веществ с ММ 18.8 и 40.9 кД (объем элюента 39.6 и 32.3 мл) как при рН 5.0, так и при рН 6.5. Наличие новых пиков на представленных хроматограммах позволяет предположить не только формирование комплекса фермента с ГК, но и прямое взаимодействие лакказы с ними, которое приводит к полимеризации последних (лакказа-инициированная полимеризация).

Чтобы подтвердить высказанное предположение об образовании комплекса лакказа-ГК, нами была исследована ферментативная активность фракций, полученных при гель-хроматографическом анализе. Так как характер гельхроматограмм по профилю ферментативной активности не изменялся, на рис. приведена только типичная хроматограмма после 24 ч инкубирования.

Полученные результаты показали, что наибольший пик ферментативной активности совпадал с пиком появившейся высокомолекулярной фракции. При этом данная фракция содержала более 80% общей лакказной активности фракционируемого образа. Это свидетельствует об образовании ферментативно активного комплекса лакказа-ГК в изучаемых условиях.

A254 Активность лакказы, % от общей 0 V, мл Рисунок 5. Гель-хроматограммы системы лакказа–ГК с УФ-детекцией (сплошная линия) и детекцией по активности лакказы (пунктирная линия) при совместной инкубации при рН 5.0 в течение 24 ч.

Для исследования природы образующегося комплекса был использован метод изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в полиакриламидном геле (ПААГ) с окрашиванием белка Coomassie Blue R-250. Образование комплекса должно было привести к изменению изоэлектрической точки (рI) лакказы, что должно было отразиться на поведении фермента в условиях ИЭФ.

а б Рисунок 6. Изоэлектрофореграммы системы лакказа–ГК и ее отдельных компонентов в процессе инкубации при рН 5.0 (а) и рН 6.5 (б). 1 – ГК; 2, 3 – лакказа после 0 и 168 ч инкубации; 4, 5, 6 – система лакказа-ГК после 0, 72 и 168 ч инкубации.

Как видно из представленных электрофореграмм (рис. 6), поведение лакказы не менялось в ходе проведения эксперимента и не зависило от присутствия ГК в растворе. Полученные результаты демонстрируют нестабильность образующегося комплекса лакказа-ГК в условиях ИЭФ, что свидетельствует о его нековалентной природе.

Таким образом, при изучении системы лакказа-ГК установлена сложная природа их взаимодействия. Показано прямое взаимодействие фермента с ГК, приводящее к лакказа-инициированной полимеризации ГК и образованию компонентов более высокой молекулярной массы. Кроме того, установлено формирование комплекса лакказа-ГК с нековалентной природой связи. На основании полученных данных можно предположить, что в формировании комплекса участвуют силы ван-дер Ваальса, гидрофобные, - и CH- взаимодействия.

Взаимодействие лакказы Coriolus hirsutus с атразином Исследование взаимодействия лакказы C. hirsutus с атразином проводили путем их инкубирования в 50 мМ калий-фосфатном буфере при рН 5 в течение 72 ч при 27°С. Изменения концентрации атразина в реакционной смеси определяли с использованием метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (ELISA).

Начальные концентрации атразина и лакказы в реакционной смеси составляли 5 мг/л и 0.05 мг/мл, соответственно. В процессе инкубации изменения концентрации атразина в системе не наблюдалось.

Влияние лакказы на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами Исследование взаимодействия атразина с ГК проводили при внесении ГК в концентрации 40 мг/л и атразина 5 мг/л.

На первом этапе исследования изучали взаимодействия атразина с ГК без внесения лакказы.

Как показали эксперименты, в присутствии ГК происходит уменьшение концентрации атразина в растворе: через сутки на 10 %, а через 7 – на 60 % (рис. 7).

Очевидно, это отражает процесс адсорбции ксенобиотика на ГК. Убыли атразина при инкубации его в системе, содержащей лакказа–ГК, не наблюдалось. По-видимому, взаимодействие ГК с ферментом, приводящее к образованию комплекса и модификации ГК, подавляет адсорбцию ксенобиотика. Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что лакказа не инициирует процесс окислительного связывания атразина ГК, а, наоборот, препятствует адсорбции гербицида. Поэтому следующим этапом нашей работы стало исследование процессов, происходящих в системе лакказа-атразин-ГК с добавлением редокс-медиаторов фермента.

Общепринятым считается, что необходимым (однако не всегда достаточным) условием использования химического соединения в качестве редокс-медиатора лакказ является его способность окисляться ферментом в присутствии кислорода воздуха, т.е. соединение фактически должно быть субстратом фермента. Кроме того, одним из ключевых параметров является способность редокс-медиатора существовать в устойчивой высоко реакционно-способной форме значительный временной промежуток. В качестве субстратов лакказы для исследования возможности использования их как редокс-медиаторов были выбраны сирингалдазин, ГБТ и АБТС.

Ранее было показано, что ГБТ и АБТС могут быть использованы в качестве редокс-медиаторов фермента в различных системах детоксикации и делигнификации.

Редокс-медиаторные свойства сирингалдазина были исследованы впервые.

Сирингалдазин, ГБТ и АБТС были исследованы в качестве медиаторов лакказы в системе, содержащей ГК и атразин. Существенная убыль атразина наблюдалась только при использовании в качестве редокс-медиатора ГБТ (рис. 7). Через сутки в растворе обнаруживали 50%, через 7 – 30% от его начальной концентрации. В остальных случаях – при использовании в качестве редокс-медиаторов АБТС и сирингалдазина – концентрация атразина снижалась незначительно.

Концентрация атразина, % от начальной 0 1 2 3 4 5 6 7 Время инкубации, сут Рисунок 7. Динамика убыли атразина в присутствии ГК (•), системы лакказа-ГК (), лакказа-ГК-ГБТ ().

Наблюдаемый факт можно объяснить тем, что при использовании AБTС и сирингалдазина происходит взаимодействие образующихся высоко реакционноспособных продуктов и самих соединений с ГК, приводящее к адсорбции как данных соединений, так и их высоко реакционно-способных продуктов на ГК.

Таким образом, процесс взаимодействия атразина с ГК в присутствии лакказы в значительной степени определяется свойствами используемых редокс-медиаторов.

Влияние лакказы Coriolus hirsutus на взаимодействие атразина с гуминовыми кислотами в гетерогенной среде Для изучения взаимодействия атразина с ГК в гетерогенной среде эксперименты проводили на почвенных образцах (табл. 2 и 3). Все отобранные почвы характеризовались относительно высоким содержанием органического углерода (>1%), что свидетельствовало об отсутствии в них открытых минеральных поверхностей. Поэтому почвенные образцы в данной работе рассматривали как ГК, иммобилизованные на минеральной подложке. Кроме того, проведенные анализы показали отсутствие в образцах ферментативной активности. Это позволило нам предполагать, что ферментативная активность в системе обусловлена только вносимой лакказой.

Влияние лакказы Coriolus hirsutus на процессы адсорбции и десорбции атразина на почвах Влияние лакказы C. hirsutus на взаимодействие атразина с различными почвами изучали путем сравнения адсорбции и десорбции гербицида в отсутствии и присутствии фермента.

На рис. 8 представлены адсорбционно-десорбционные изотермы атразина на различных типах почв в отсутствии и присутствии лакказы C. hirsutus. Было установлено, что при десорбции атразина в вариантах с начальной концентрацией гербицида 3 мг/л определяемые концентрации были близки к нижнему пределу обнаружения (0.5 мг/л методом ВЭЖХ), что затрудняет интерпретацию получаемых данных. Поэтому в работе приведены результаты десорбции атразина только для вариантов с начальными концентрациями 5, 8 и 10 мг/л (табл. 4).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»