WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Давидчик Валентина Николаевна ДЕГРАДАЦИЯ АТРАЗИНА ПО МЕХАНИЗМУ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГРИБНОЙ ЛАККАЗОЙ Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в группе «Ферментативные основы биодеградации» Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук О.В. Королева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Б. Градова доктор биологических наук, профессор О.Л. Озерецковская

Ведущая организация:

ГНУ Почвенный институт им. В.В. Докучаева Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится «29» мая 2007 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан «28» апреля 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В связи с возрастающим загрязнением окружающей среды в целом и земельных ресурсов в частности, остро стоит вопрос создания эффективных биотехнологий для детоксикации загрязненных почв. Одной из доминирующих групп ксенобиотиков в почвах являются гербициды, широко применяемые для контроля численности сорной растительности. Однако неправильное использование гербицидов (превышение доз внесения, нарушение схем применения и др.) часто приводит к негативным последствиям: загрязнению сельскохозяйственной продукции, почв, грунтовых и поверхностных вод.

Наиболее опасным с точки зрения функционирования биогеоценозов является загрязнение высокоустойчивыми гербицидами, одним из наиболее распространенных представителей которых является сим-триазиновый гербицид атразин. Согласно литературным данным, основным фактором, определяющим накопление атразина в почвенном профиле и уровень проявляемой им токсичности, является его связывание с гуминовыми кислотами (ГК). ГК являются основной компонентой органического вещества почвы, где они представлены как в растворенном, так и иммобилизованном на минералах состоянии.

Несмотря на то что сорбционные процессы между атразином и компонентами органического вещества хорошо изучены, единого мнения о механизме связывания ГК с этим гербицидом не существует. Одной из наиболее распространенных гипотез является связывание по механизму гидрофобного взаимодействия и образование комплексов с переносом заряда. При связывании атразина происходит уменьшение его свободной концентрации в почве и, как следствие, снижение токсичности. Однако при изменении условий может происходить десорбция гербицида, что приводит к увеличению его мобильности и токсичности.

С другой стороны, для ряда ксенобиотиков фенольной и аминной природы показана возможность их необратимого включения в структуру ГК с образованием ковалентных связей по механизму окислительного связывания. Для протекания указанного процесса необходимо наличие катализаторов, в качестве которых в почвах выступают оксидоредуктазы различной природы: пероксидазы, лакказы и полифенолоксидазы. Для атразина возможность окислительного связывания с ГК практически не изучена, а существующие литературные данные противоречивы. В ряде исследований было показано, что внесение пероксидазы не увеличивало адсорбционную способность почв по отношению к атразину, а в некоторых вариантах приводило к снижению последней. Влияние других оксидоредуктаз, таких как лакказа, на связывание атразина почвами не изучено. Показано, что высшие и низшие грибы участвуют в процессах трансформации атразина. Установлено, что одним из таковых ферментов этих процессов является лакказа (n-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2).

Отличительными чертами данного фермента являются: высокая активность в почве в течение круглого года, широкая субстратная специфичность и высокая термо- и рН-стабильность. Кроме того, лакказа является единственной фенолоксидазой, экстрагируемой из почвы в составе ГК. Основными продуцентами лакказы в почвах являются грибы «белой гнили», представителем которых является Coriolus hirsutus. В настоящее время лакказы и продуцирующие их базидиальные грибы получили широкое применение в биотехнологии как для утилизации лигнинсодержащих отходов, так и рекультивации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами (ПХБ), полиядерными ароматическими углеводородами (ПАУ), синтетическими красителями и пестицидами.

Это обусловило актуальность и важность проведения исследований, направленных на изучение влияния лакказы на механизмы адсорбции и десорбции атразина. Данные исследования позволят не только установить возможность окислительного связывания этого гербицида с ГК при участии лакказы, но и оценить роль фермента в процессе детоксикации ксенобиотиков сим-триазиновой природы, что даст основу биотехнологическим подходам к рекультивации загрязненных территорий.

Цель работы. Целью работы являлось исследование влияния лакказы на процессы взаимодействия атразина с гуминовыми кислотами в растворенном и иммобилизованном состоянии для установления механизма деградации гербицида in vivo.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выделить и охарактеризовать грибную лакказу базидиомицета Coriolus hirsutus;

- провести отбор и характеристику почвенных образцов из различных почвенно-географических зон;

- исследовать взаимодействия, протекающие в гомогенной системе лакказа–атразин-растворенные ГК, включая изучение процессов взаимодействия фермента с гуминовыми кислотами;

- исследовать взаимодействия, протекающие в гетерогенной системе лакказа – атразин – почвенные частицы, включая изучение процессов адсорбции/десорбции атразина и роли фермента в данном процессе;

- оценить возможность детоксикации почвы, загрязненной атразином, с помощью системы лакказа-ГК.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование трансформации атразина в системе почва-растение-вода и предложен механизм его взаимодействия с компонентами исследованной системы. Установлено, что взаимодействие лакказы с основным компонентом органического вещества – ГК – имеет сложный характер и включает процессы стабилизации фермента с образованием комплексов лакказа-ГК, трансформацию ГК и частичную их деградацию. Впервые показано, что для ковалентного связывания атразина ГК по механизму окислительного связывания, катализируемого лакказой, необходимо присутствие в системе также редокс-медиаторов лакказы. Впервые проведено систематическое исследование адсорбционного поведения гербицида атразина в непрерывном зональном ряду «дерново-подзолистые почвы – серые лесные почвы – черноземы» в присутствии и в отсутствии лакказы; установлено, что внесение лакказы приводит к значительному увеличению константы связывания атразина в изученных почвах. Таким образом, внесение лакказы (или присутствие фермента в природных системах) приводит к необратимой адсорбции атразина почвами.

Установлено, что в модельной системе растения – растворенные ГК – лакказа – атразин – почва процесс детоксикации атразина проходит по механизму окислительного связывания, причем почва является источником редокс-медиаторов фермента.

Практическая значимость работы. Полученные данные могут быть использованы для разработки систем биоремедиации почв, загрязненных ксенобиотиками. Исследование детоксицирующего потенциала ГК показало значительную эффективность их использования в качестве адсорбентов. Полученные данные о биологической активности ГК и их детоксицирующей способности позволили разработать подходы к созданию нового типа биоудобрений.

Апробация работы. Отдельные части работы были представлены на конференции «XII International Meeting of International Humic Substances Society» (SaoPedro, Brazil, 2004); на 2-м Московском международном конгрессе по биотехнологии «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); на 4-м съезде Докучаевского общества почвоведов «Почвы – национальное достояние России» (Новосибирск, 2004); на 10th Nordic IHSS Symposium «Roles of Humic Substances in Nordic Environment» (Riga, Latvia, 2005); на III Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (Санкт-Петербург, 2005); на International conference «Biocatalysis – 2005: fundamentals and applications» (St. Petersburg, Russian Federation, 2005).

Публикации. По материалам работы опубликовано 2 статьи и 7 тезисов докладов.

Структура диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы включает 135 наименований.

Иллюстративный материал содержит 20 рисунков и 8 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика основных компонентов исследованных систем:

лакказы, гуминовых кислот и почв различных почвенно-географических зон Выделение и характеристика лакказы из Coriolus hirsutus Лакказа (КФ 1.10.3.2) была выделена из культуральной жидкости штамма Coriolus hirsutus. Выделение и очистку внеклеточной лакказы из культуральной жидкости базидиомицета, выращенного в условиях глубинного культивирования, проводили по разработанной ранее методике, включающей осаждение 90% сульфатом аммония, очистку методом ионообменной хроматографии на DЕАЕToyopearl 650M с последующей рехроматографией на том же носителе.

Было установлено, что полученный ферментный препарат содержал два изофермента лакказы: изоферменты А и В. При этом изоформа А была доминирующей и составляла около 90%. Так как изоформа В присутствовала в исследуемом ферментном препарате в незначительных количествах, мы проводили дальнейшие исследования на изоформах А. Гомогенность полученного препарата изоформы А контролировали с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. Исследование рН оптимума проводили в диапазон рН от 3.до 7.0 в универсальной буферной системе с интервалом рН 0.5. В качестве субстратов фермента использовали 2,2-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (АБТС) рН 3.0, сирингалдазин и 1-гидроксибензотриазол (ГБТ) (в дальнейшей работе данные соединения были использованы в качестве редокс-медиаторов лакказы).

Полученные данные показали, что рН–оптимум был в области от 4.4 до 4.6 и не отличался для двух изоформ фермента (разброс рН-оптимума). Поэтому нами значение рН–оптимума было принято равным 4.5.

Выделение и характеристика препарата гуминовых кислот В работе использовали препарат ГК угля, полученный из коммерческого препарата гумата угля Powhumus (Humintech GmbH, Германия). Перед использованием препарат гумата переводили в Н+-форму путем равновесного диализа с использованием мембран с пределом пропускания 3 кД. Полученный препарат ГК угля был охарактеризован методами элементного анализа, эксклюзионной хроматографии и 13С ЯМР спектроскопии (табл. 1).

Таблица Элементный состав, молекулярная масса (ММ) и распределение углерода по основным структурным фрагментам в использованном в работе препарате ГК угля Атомные отношения Содержание углерода в основных (на сухую беззольную навеску) структурных фрагментах, % ММ, кД H/C O/C C/N CC=O CCOO CAr CAlk 0.87 0.50 53 9.4 5.7 19.0 62.7 12.Полученные характеристики ГК угля были типичными для аналогичных препаратов.

Характеристику биологической активности оценивали стандартным биотестом, основанным на стимуляции роста колеоптилей (ауксиноподобная активность).

Проведенное исследование ауксиноподобной активности показало, что при низких концентрациях ГК (<20 мг/л) происходит активация роста колеоптилей, а при дальнейшем повышении концентрации (до 100 мг/л) стимулирующая активность ГК снижалась, и значимого отличия прироста длины колеоптилей от контроля не наблюдали. Это свидетельствует о том, что биологическая активность ГК не отличается от таковой у аналогичных препаратов.

Отбор и характеристика почвенных образцов Для проведения исследований использовали почвы, отличающиеся по физикохимическим свойствам и содержанию органического вещества. С этой целью отбор почвенных образцов производили в различных почвенно-географических зонах: в Московской области были отобраны образцы дерново-подзолистой почвы, в Тульской – серой лесной почвы, в Курской – чернозема. Пробоотбор производили из верхнего гумусо-аккумулятивного горизонта в слое 0-5 см. Образцы почв характеризовали по следующим химическим и физическим свойствам: рНВОД, содержание обменных форм Са, Mg и К, общее содержание органического углерода СОРГ (табл. 2), гранулометрический состав (ГМС) (табл. 3).

Таблица Некоторые физико-химические характеристики исследованных почв Химические характеристики Дерново-подзолистая Серая лесная Чернозем рНВОД 4.7 6.8 6.СОРГ, % 3.7 2.0 5.Обменный Ca, ммольэкв/100г 3.1 10.7 30.Обменный Mg ммольэкв/100 г 1.2 8.6 6.Обменный К ммольэкв/100 г 0.3 0.5 0.Таблица Гранулометрический состав (ГМС) исследованных почв Содержание гранулометрических фракций (мм), % Почва 1.00- 0.25 0.05 0.01- 0.005<0.0.25 -0.05 -0.01 0.005 0.Дерново-подзолистая 6.6 26.3 47.5 8.4 7.9 3.Серая лесная 0.2 12.5 51.5 9.1 11.2 15.Чернозем 0.9 15.7 43.4 7.7 11.1 21.Из приведенных данных видно, что из исследованных почв дерновоподзолистая почва характеризуется наибольшим уровнем кислотности почвенного раствора. Для чернозема и серой лесной почвы рН водной вытяжки были приближены к нейтральному значению. Для чернозема характерно более высокое содержание СОРГ (5.8%), по сравнению с дерново-подзолистой и серой лесной почвами.

Наиболее высокое содержание обменных форм Са и Mg было отмечено для чернозема и серой лесной почвы, наименьшее – для дерново-подзолистой почвы, что связано с высоким уровнем кислотности почвенного раствора.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»