WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

начальное состояние начальное состояние а б 2,0 состояние через 50 мин (контроль) 2,состояние через 50 мин в ослабленном МП 1,8 1,1,6 1,1,4 1,1,1,1,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 500 А mV А mV возбуждения возбуждения Рис. 2 (а) Изменение порогового значения ПД нервного волокна в контроле (H=42,3±0,4 мкТл); (б) Изменение порогового значения ПД нервного волокна в ОМП при стимуляции (Н=0,17±0,02 мкТл). По оси абсцисс амплитуда подаваемого возбуждения, по оси ординат амплитуда ПД. Графики приведены для случая, когда в интервалах между измерениями осуществлялась непрерывная стимуляция нервного волокна с амплитудой 300 мВ.

Известно, что при ритмическом возбуждении нерва увеличение порога и снижение амплитуды ПД могут быть обусловлены комплексом процессов, обусловленных состоянием вязкости и проницаемости аксолеммы, меняющих конформацию мембранных каротиноидов [Максимов, 1997].

Мы предположили, что в качестве чувствительных к действию ОМП процессов, при ритмическом возбуждении нерва, могут быть перераспределение электронов и изменение конформации полиеновой молекулы каротиноидов.

2.Исследование изменений в спектрах молекул С40-каротиноидов при ослаблении МП в ~200 раз.

Известно, что в плазматической мембране нервного волокна и в цитосомах нейронов, содержатся С40-каротиноиды (Рис. 3В). При перераспределении или делокализации -электронов в полиеновой цепочке каротина, меняется характер спектра РКР данной молекулы. Известно, что конформация каротиноидов зависит от вязкости микроокружения, A, mV A, mV мембранного потенциала, транспорта ионов через мембрану, а также количества связанного Са2+ и NО [Koyama et. Al., 1979; Максимов и др. 1982;

Ульянова и др. 2005].

В нервном волокне каротиноиды содержатся в мембране аксолемы и миелине, причем в мембране содержание каротиноидов составляет ~75%, а остальные располагаются в миелине [Максимов, 1997]. С помощью микроспектрометрии нами было показано, что в цитоплазме нейронов прудовика и катушек, цитосомы распределены неравномерно: поглощение каротиноидов наблюдается только на периферических участках клетки, где выявлены скопления цитосом (рис. 3А).

D, отн. ед.

Б А 0.0.0.-0.400 450 500 550 600, нм В Рис. 3. А – Спектры поглощения: (1) участка клетки со скоплением цитосом; (2) участка клетки без цитосом. Б – спектр комбинационного рассеяния нейронов нервного окологлоточного кольца катушек. В – структурная формула молекулы каротина.

Нами было проведено исследование изменения конформации выделенного -каротина, а так же каротиноидов, содержащихся в нервном волокне и цитосомах нейронов окологлоточного кольца при действии лабораторного магнитного поля (H=39,7±0,4 мкТл), и изменения при компенсации постоянной составляющей ГМП в ~200 раз (H=0,20±0,03 мкТл).

Для компенсации использовались расположенные перпендикулярно друг к другу 3 пары колец Гельмгольца. От каждого образца получали последовательно 6 спектров, по 20 серий для каждого из объектов. В спектре РКР каротиноидов (рис. 3Б) обнаружены три характерных пика с длиной волны 1526 см-1 (колебания –C=C– связей), 1160 см-1 (колебания =С–С= связей) и 1008 см-1 (колебания С–СН3 метильного радикала) соответственно.

В качестве одного из критериев изменений конформации в молекуле, используют отношение пиков интенсивностей КР - спектров I1526/I1160, I1526/I1008, I1160/I1008. В частности, величина соотношения интенсивностей I1526/I1160 пиков КР-спектра каротиноидов линейно зависит от степени упорядоченности жирнокислотных «хвостов» мембранных липидов [Максимов и др., 1990].

2,0 I1160/I I1160/I2,а б I1526/I1, I1526/I1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,0,0,0 15 30 45 60 75 90 0 15 30 45 60 75 90 t, мин t, мин Рис. 4. (а) Соотношения интенсивностей полос КР- спектров раствора -каротина в лабораторном поле (H=39,7±0,04 мкТл). (б) Отношения интенсивностей полос КР- спектра -каротина при компенсации постоянной составляющей в 200 раз (H= 0,20±0,03 мкТл).

Отн.

ед.

Отн.

ед.

В модельных экспериментах было показано, что ослабление МП в 200 раз не приводит к видимым конформационным изменениям каротиноидов.

На рис. 4 (а) представлены отношения пиков интенсивности для раствора каротина в контроле (лабораторное поле) и при помещении его в ослабленное МП (рис. 4(б)). Таким образом было показано, что ослабление МП не влияет на делокализацию -электрона полиеновой системы молекул и конформацию каротиноидов.

Для каротиноидов, локализованных в нервном волокне и цитосомах нейронов, было показано, что действие ОМП приводит к росту величин отношения пиков интенсивности (рис. 5(б), 6(б)).

При этом изменения каротиноидов, локализованных на плазматической мембране миелинового нервного волокна, более выражены, чем изменения каротиноидов, локализованных в субклеточных органеллах нейронов.

Известно, что увеличение отношения I1526/I1160 соответствует увеличению микровязкости фосфолипидного окружения, которое наблюдали при блокировании тетродотоксином натриевых каналов нервного волокна I1160/I2, I1160/I2,а б I1526/I I1526/I1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,0,0,0 15 30 45 60 75 90 0 15 30 45 60 75 90 t, мин t, мин Рис. 5. (а) Отношения интенсивностей полос КР спектра каротиноидов нейронов в лабораторном поле (H= 39,7±0,04 мкТл). (б) Отношения интенсивностей полос КР спектров каротиноидов нейронов при компенсации постоянной составляющей в раз (H= 0,20±0,03 мкТл).

Отн.

ед.

Отн.

ед.

I1160/I2, I1160/I2,а б I1526/ I1526/I1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,0,0,0 15 30 45 60 75 90 0 15 30 45 60 75 90 t, мин t, мин Рис. 6. (а) Отношения интенсивностей полос КР- спектров каротиноидов нервного волокна в лабораторном поле (H= 39,7±0,04 мкТл). (б) Отношения интенсивностей полос КР- спектров каротиноидов нервного волокна при компенсации постоянной составляющей в 200 раз (H= 0,20±0,03 мкТл).

[Максимов и др., 1990], так же увеличение отношения наблюдалось при гипероксии нерва. Возможно, что действие ОМП на нервную клетку влияет на диффузию О2 внутрь волокна и связывание О2 с каротиноидами.

Но изменения состояния каротиноидов могут изменить состояние цитоплазмы и мембранный потенциал, влияя тем самым на порог возбуждения и потенциал действия.

В связи с этим в следующей серии экспериментов исследовали изменения состояния цитоплазмы возбудимой клетки при действии ослабленного МП.

3.Исследование регулярных изменений показателя преломления цитоплазмы и плазматической мембраны нейронов при действии ослабленного МП.

Известно, что изменение мембранного потенциала, формы клетки, положения и объема органоидов, в частности митохондрий, влияют на оптические свойства нейронов. С помощью динамической фазовой микроскопии (ДФМ), исследовали локальные изменения коэффициента преломления изолированных нейронов, при действии ослабленного в 200 раз МП. Метод основан на регистрации изменений оптической плотности клетки Отн.

ед.

Отн.

ед.

на выбранном участке. Высота фазового профиля (ВФП) клетки определяется, как геометрическим размером клетки, так и величиной коэффициента преломления в данной точке, который зависит от распределения органелл и элементов цитоскелета (рис. 7 (а), (б)). Для негомогенных объектов, какими являются большинство клеток, фазовая высота Ф(х,у) связана с показателем преломления цитоплазмы клетки и ее геометрической высотой следующим соотношением:

z max (x, y) = (1) (n(x, y, z) - n1)dz - где n1 - показатель преломления буферного раствора, величина которого постоянна, n(x,y,z) - величина показателя преломления в точке клетки с координатами (х у) и расстоянием z от подложки, zmax - верхний предел интегрирования, выбирается выше верхней точки объекта.

Анализ, проведенный с помощью метода Фурье-преобразования, позволил нам выявить группу частот, характеризующую регулярные динамические процессы в плазматической мембране и примембранной области цитоплазмы (0,3–3 Гц). Важно, что даже в состоянии покоя Rz-нейрона нами были выявлены регулярные флуктуации локального коэффициента преломления (рис. 7 (г)). Таким образом, метод позволяет получить интегральную информацию о процессах в клетке.

Процессы, протекающие в клетке, условно можно разделить на мембранные и цитоплазматические. Исходя из этого, в эксперименте линии сканирования проводили в центре клетки и в области плазматической мембраны. В ходе исследования было показано, что в центральной части клетки изменения ВФП представляют спектр, в котором можно выявить как отдельные частоты, так и их группы. В данном случае, при сканировании регистрируются изменения, происходящие как в цитоплазме, так и в плазматической мембране.

а б 0 20 40 мкм h, нм h, нм в г 0.80.60.4-0.2 -0 5 10 15 20 25 30 0 2 4 6 8 10 12 14 t, сек f, Гц Рис. 7 (а) Фазовое изображение клетки – нейрона; (б) фазовый профиль клетки; (в) регистограмма изменение высоты фазового профиля от времени в одной из точек скан-линии, (г) спектр Фурье характеризующий изменения оптической плотности клетки в выбранной точке.

При исследовании примембранной области клетки получали спектр частот изменений ВФП, который, в отличие от центра клетки, был представлен только одной группой частот 0,3-3,0 Гц.

Данная группа характерна для обеих исследуемых областей клетки, но их амплитуда в примембранной области клетки в 1,5–2,0 раза больше, чем центральной. При сканировании на краю клетки захватываемый объем мембраны в 2-3 раза больше, чем при сканировании в центре клетки. Таким образом, группа частот 0,3-3,0 Гц изменений ВФП связана с процессами, проходящими на мембране.

Отметим, что появление некоторых частот имеет нерегулярный характер, поэтому для представления результатов удобней пользоваться вероятностью появления частот. Для этого за «полезный» пик брались те, что превышали уровень шума в 2 раза. На основе таких пиков строились графики M(f). Для статистической обработки использовалось биномиальное распределение. В исследуемом интервале частот наиболее вероятные изменения происходили в областях 0,3-3; 4-6; 8-10; 13-15 Гц. Наиболее ярко выраженные изменения ВФП наблюдались в диапазоне частот от 0,3 до 3,0 Гц. Поэтому в дальнейшем для рассмотрения был выбран этот участок, как наиболее информативный. В связи с тем, что для исследования действия ОМП на нейроны важно было выявить процессы в примембранной области клетки, то процессы в центре клетки не рассматривались. На рис. 8 (а) представлен характерный вероятностный спектр нейрона в примембранной части. Этот спектр был взят в качестве критерия действия ослабленного МП.

На рис. 8 (б) представлен спектр регулярных изменений коэффициента преломления цитоплазмы нейрона, в ОМП со степенью ~200 кратного ослабления (H=0,23±0,02 мкТл).

б а 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,f, Гц f, Гц Рис. 8. (а) Спектр клетки лабораторное поле (H=46,6±0,4 мкТл). (б) Спектр клетки в ослабленном МП (H=0,23± 0,02 мкТл).

M(N) M(N) Геомагнитное поле компенсировали с помощью трех пар колец Гельмгольца, расположенных перпендикулярно по отношению друг к другу.

Величину постоянной компоненты магнитного поля контролировали с помощью магнитометров. Время нахождения нейрона в ослабленном МП составляло 50 мин. Для каждого типа измерений была набрана статистка на клетках.

Для проверки предположения, что изменение спектра при действии ОМП на нервную клетку, связанно с деполяризацией плазматической мембраны, было проведено исследование действия поляризующих агентов на регулярные изменения коэффициента преломления цитоплазмы нейрона.

На рис. 9 представлены спектры, полученные при действии на нейрон блокатора К+ канала (тетраэтиламмония (ТЭА)) и экстраклеточного раствора с повышенным содержанием ионов калия (К+-деполяризация). При действии ТЭА наблюдалось значительное снижение вероятности появления частот на всех интервалах, а при инкубации клетки в среде с повышенным содержанием калия наблюдается уменьшение вероятности появления частот ВФП (в интервале от 0,3 до 3,0 Гц.).

а б 15 10 5 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,f,Гц f,Гц Рис. 9 (а). Спектр регулярных изменений коэффициента преломления цитоплазмы клетки в среде с 50мМ К+. (б) Спектр регулярных изменений коэффициента преломления цитоплазмы клетки в растворе с тэтроэтиламмонием. Лабораторное поле (H=46,6±0,4 мкТл) M(N) M(N) В данном исследовании нами было выявлено уменьшение вероятности возникновения группы частот 0,7-0,9 Гц; 1,2-1,5 Гц, а также отдельной частоты 2,0 Гц (рис. 9 (б)). Незначительно увеличилась вероятность на частотах 1,6-1,Гц; 2,5-3,0 Гц, и на отдельной частоте 0,6 Гц.

Установлено, что действие нейромедиаторов (ацетилхолина (АХ) и серотонина (5-НТ)), деполяризующих мембрану нейрона, приводит к увеличению амплитуд регулярных изменений коэффициента преломления цитоплазмы, и увеличению вероятности появления частот в наблюдаемом интервале.

Итак, деполяризация плазматической мембраны нейрона меняет спектр регулярных изменений оптической плотности цитоплазмы нейрона аналогичным образом, как и действие ослабленного МП (рис. 9 (а)). Как отмечалось ранее, в характер спектра вносят вклад интегральные клеточные процессы. Изменение ВФП клетки связано с флуктуациями коэффициента преломления цитоплазмы, что в свою очередь, может определять ход различных процессов. В связи с этим, рассмотрим возможные цитоплазматические процессы клетки, меняющие ВФП. Известно, что в клетках, в том числе и в нейронах, имеет место циклическое движение цитоплазмы, где с цитоплазмой движутся молекулы и органеллы (митохондрии, цитосомы). Очевидно, что прохождение этих объектов через область сканирования вносит свой вклад в интегральное изменение оптической плотности. Аналогичное влияние на изменение оптической плотности цитоплазмы клетки может оказать и процесс миграции цитоплазматических везикул в клетке. Вероятно, изменения оптической плотности могут быть связаны с процессами, происходящими на мембране клетки, такими, как изменения вязкости (латеральная диффузия) и флуктуации примембранного объема цитоплазматических структур. Так, кинетика изменений коэффициента преломления плазматической мембраны аксона, четко коррелирует с фазами ПД, а регулярные изменения коэффициента преломления цитоплазмы – с циклозисом и перемещением везикул в нейроне [Cohen. 1973, Браже и др., 2006].

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»