WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

0,Увеличенный фрагмент Рис. 13. Десорбция 100 мк г/мл 0,10 мк г/мл выделенной области антител с поверхности 0,03 3 мк г/мл 0, 0,02 сенсора под действием 0,0,морфина с -0,0002 концентрациями 3, 10 и 0 3 6 9 1 2 1 -0, 100 мкг/мл -0,0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 Вр е м я протека ния процесса, мин Интенсивный изгиб балки в начале процесса десорбции антител при введении морфина (5–10 мин) объясняется резким снятием напряжения в рецепторной пленке (рис. 13) при появлении в ней структурных дефектов. После интенсивного изгиба Н/м Поверхностное натяжение, Поверхностное натяжение, Н/м кантилевера, сопровождающегося разрушением монослоя связанных молекул антител, начинается параллельный конкурирующий процесс реорганизации белкового слоя в рецепторе, что приводит к значительному замедлению развития напряжений в пленке и потере информативности аналитического сигнала.

Таким образом, с использованием микрокантилеверов впервые проведены реакции образования и разрушения биополимерных комплексов на поверхности кантилевера по конкурентной схеме. Пороговая чувствительность сенсора к морфину составила 3 мкг/мл. Полученные результаты позволяют говорить о потенциальной применимости микрокантилеверных преобразователей для детектирования низкомолекулярных веществ в плазме крови животных или человека.

В разделе 4.2 основной задачей являлось определение возможности прямого анализа белков с помощью микрокантилеверных систем, а точнее, экспериментальное определение степени латеральных напряжений в монослойной пленке макромолекул IgG при связывании с классическим белком – пероксидазой хрена (ПХ). Во многих методах прямого анализа аналитический сигнал вырабатывается в результате изменения плотности рецепторного слоя, которое может быть обусловлено также неспецифическим связыванием посторонних биополимерных объектов, содержащихся в анализируемом растворе. В случае определения фактов связывания аналита с помощью измерения сил, генерируемых в белковом слое, степень влияния неспецифического связывания на аналитический сигнал заметно уменьшается благодаря низРис. 14. Архитектура рецептора микроканким энергиям неспецифических святилеверного анализатора пероксидазы хрезей и, следовательно, их незначи- на: а) при иммобилизации IgG с помощью белка А на позолоченную сторону кантилетельному вкладу в поверхностное навера, б) при ковалентной иммобилизации тяжение рецепторной пленки.

антител на кремниевую сторону кантилевера.

В данной работе ставилось целью сопоставление эффективности методов физической иммобилизации (с помощью белка А) и статистической ковалентной прививки IgG на поверхности кантилевера (рис. 14) по отношению к генерируемому сигналу связывания антигена. Для исключения неспецифического связывания c немодифицированной поверхностью кантилевера, не имеющей рецепторного слоя, она блокировалась химически привитым БСА (метод ковалентной иммобилизации белков описан в разделе 4.1.2).

После добавления ПХ в фосфатный солевой буферный раствор (ФСБР) с pH = 7,0 кантилевер с физически иммобилизованным рецептором начинал деформироваться в сторону рецепторного слоя (кинетика изгиба показана на рис. 15).

0,Рис. 15. Кинетика из0 2 4 6 8 10 12 14 -0,гиба кантилевера с Пероксидаза хрена (3 мкг/мл) -0,физически иммобилиЭкспоненциальное приближение зированным рецеп-0,торным слоем при -0,Ввод пероксидазы введении раствора ПХ -0,с концентрацией -0,3 мкг/мл.

Время протекания процесса, ч После регенерации сенсора в глициновом буфере с pH = 3,0 и повторной постадийной иммобилизации антител его чувствительность к пероксидазе понизилась более чем в четыре раза (см. табл. 1).

С помощью атомно-силового микроскопа был произведен контроль свойств поверхности рецепторного слоя кантилевера на стадиях подготовки и функционирования сенсора. На рисунке 16 показаны изменения параметров шероховатости поверхностей в результате появления на ней новых белковых комплексов:

N N N 1 Rq = Ra = rn,, r Rsk = 1, Rmax, n r N N NRq n=1 n n=1 n=где Ra, Rq, Rsk, Rmax – средняя и среднеквадратичные шероховатости, параметр симметрии, максимальный профиль поверхности соответственно; rn – высоты точек массива изображения; N – число точек. Исходя из данных, полученных с помощью АСМ, можно сделать вывод, что на поверхности образуются специфические иммунные пары антител с пероксидазой, которые изменяют рельеф рецепторного слоя с увеличением параметров шероховатости, т.е. на поверхности появляются качественно новые объекты, очевидно, влияющие на развитие сил в сенсорном слое.

Поверхностное натяжение,Н/м б а 1,г в Ra 0,Rmax 0,Rq 0,Rsk 0,Белок А Белок А+IgG Белок А+IgG+ПХ Рис. 16. Изображения поверхностей золота с нанесенными а) белком А, б) белком А и IgG, в) белком А, IgG и ПХ; г) графики нормированных шероховатостей каждой из поверхностей.

При высоком уровне воспроизводимости после нескольких циклов регенерации кантилевер с ковалентно иммобилизированными макромолекулами IgG (рис.17) показал чувствительность в полтора раза меньшую, чем в случае иммобилизации антител с помощью белка А. Блокировка поверхности сенсора, не являющейся рецепторным слоем, обеспечила невосприимчивость анализатора к внешним неспецифическим воздействиям контрольных белков (БСА и овальбумина) при высоких концентрациях (рис. 17).

Сопоставляя результаты контроля иммунохимических реакций на поверхности кантилевера (табл. 1), можно увидеть, что в результате физической иммобилизации антител на поверхности кантилевера силы, возникающие в монослое антител, в полтора раза больше, чем при химической прививке. Это связывается с увеличен Шероховатость (Ra, Rmax, Rq, Rsk), нм ной мобильностью молекул IgG на поверхности в комплексе с белком А и жесткой детерменированностью их посадки на поверхность, в результате чего конформационные изменения молекул IgG при образовании иммунной пары могут быть большими, чем при случайной химической иммобилизации антител.

0,0,0,0,0,0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,-0,-0,Контроль1 БСА (1 мг/мл) -0,Контроль2 Овальбумин (1 мг/мл) -0,2 Пероксидаза цикл N (3 мкг/мл) Пероксидаза цикл N+1 (3 мкг/мл) -0,Время протекания процесса, ч Рис. 17. Кинетика изгиба кантилевера с ковалентно иммобилизированным рецепторным слоем при N-ом и (N+1)-ом циклах регенерации в глициновом буфере (pH = 3,0) при введении раствора ПХ с концентрацией 3 мкг/мл. Контрольные белки БСА и овальбумин с концентрациями 1 мг/мл. Нулевой уровень отклонений кантилевера сигналов контрольных белков для наглядности смещен в сторону отрицательных значений.

Известно, что в непосредственной близости к поверхности многие белковые молекулы из-за частичной денатурации могут в значительной степени изменить свою конформацию, кроме того при афинном типе связывания IgG с белком химическая прививка не позволяет молекулам IgG естественным образом изменять пространственную структуру, т.е. константа связывания антител может уменьшиться.

Поверхностное натяжение,Н/м Таблица 1. Сравнение характеристик рецепторных слоев молекул IgG, закрепленных на поверхности с помощью методов физической и химической иммобилизации.

Параметры Чувствительность (мак- Воспроизводимость Невосприимчи- Скорость рабо анализатора симальная сила изгиба после регенерации вость к БСА и ты сенсора при при одинаковых концен- (отношение сил из- овальбумину одинаковых трациях, 3 мкг/мл, за гиба кантилевера до концентрациях Метод время работы анализато- и после его регене- анализируемого иммобилизации ра), Н/м. рации) вещества, ч-Физическая при- БСА – есть вивка Овальбумин – 0,33±0,0,28± 0,03 0,23±0,данных нет Химическая БСА – есть прививка Овальбумин – 0,77±0,0,18± 0,02 0,89±0,есть Химическая прививка показала два основных достоинства, связанных с более высокой концентрацией IgG на поверхности, обеспеченной методом иммобилизации: повышенная скорость определения аналита и высокая степень воспроизводимости результатов после физического разрушения белкового комплекса IgG и ПХ с помощью глицинового буфера (pH = 3,0). Высокая степень воспроизводимости по максимальной силе аналитического сигнала (чувствительности) связана, повидимому, с отсутствием сложных белковых комплексов, помимо образовавшихся иммунных пар в рецепторном слое, которые в «кислой» среде глицинового буфера (pH = 3,0) могут необратимо агрегировать, из-за чего константа связывания антител может значительно понизиться. При обоих способах посадки молекул IgG было обнаружено, что связавшиеся молекулы пероксидазы повышают поверхностное натяжение рецепторной пленки, поэтому кантилевер изгибается в сторону иммобилизированного слоя антител. Аналогичные результаты, полученные на других объектах исследования, объяснялись некоторыми авторами изменением электростатического заряда и полярности образующихся иммунных комплексов. На основе полученных данных (табл. 1), предполагается также, что ослабления латеральных сил в биополимерной пленке могут быть связаны с эффектом уменьшения конфигурационной энтропии комплексов, обусловленной увеличением компактности или «жесткости» иммунных пар. В более общей форме генезис поверхностного натяжения белковых пленок связывается с реорганизацией ее субъединиц, стремящихся минимизировать свободную энергию системы в целом.

Глава 5 посвящена исследованию процессов образования фибрилл вблизи поверхности в зависимости от ее типа на примере лизоцима из куриных яиц.

Для определения кинетики агрегации лизоцима вблизи поверхности белок c концентрацией 1мг/мл иммобилизировался на поверхности кантилевера, покрытой золотой пленкой, с помощью метода химической прививки из ацетатного буфера (pH = 4,5). Белок также химически прививался к гидрофильной кремниевой поверхности кантилевера в то время, когда его сторона, покрытая золотом, оставалась немодифицированной. Установлено, что время процесса агрегации соседних молекул ковалентно иммобилизованного монослоя лизоцима на золоте при комнатной температуре и pH = 3,0 составляет 14 часов, после чего в монослое возникает плотная сетка фибриллярных образований. Как известно, агрегация в объеме происходит в тех же условиях при более высокой температуре, 57 оС.

Рис. 18. Зависимость от времени 0,а поверхностного натяжения плен0,ки лизоцима, находящейся а) на 0,01 кремниевой и г) золотой поверхб ностях кантилевера. б), в) Резуль-0,0 2 4 6 8 10 12 в таты двух контрольных экспери-0,ментов, единственное отличие -0,которых заключается в отсутствии этапа обработки кантилевера -0,лизоцимом, показаны соответстг -0,венно для золотой и кремниевой Время протекания процесса, ч поверхностей кантиливера.

Обнаружено также, что кинетический коэффициент развития латеральных напряжений в монослое лизоцима на модифицированной гидрофобной (золотой) поверхности в 4.6 раз выше, чем на модифицированной гидрофильной (кремниевой) поверхности (рис.18), что коррелирует с данными атомно-силовой микроскопии, согласно которым среднее количество фибрилл на указанных подложках различается в 5 раз (рис. 19). Таким образом, было установлено, что скорости роста фибрилл пропорциональны скоростям развития сил агрегации молекул лизоцима на поверхностях с различными свойствами.

Поверхностное натяжение,Н/м б) 4,5 ч. высота фибрилл 3.0±0.4 нм а) 1 мин., фибриллы отсутствуют в) 19 ч., плотная сетка фибрилл: более 30 на кадре г) после 16 ч., плотность фибрилл: 5±2 на кадре 13Х13мкм, высота фибрилл 3-10 нм 13Х13мкм Рис. 19. Изменение формы агрегатов лизоцима на гидрофобной поверхности золота а), б), в) и гидрофильной отрицательно заряженной поверхности слюды (кремния); г) в различные моменты времени нахождения монослоя в буфере (pH = 3,0) при химической иммобилизации белка.

Для расчета силы взаимодействия двух соседних молекул лизоцима в пленке на основе экспериментальных данных (рис. 18а, г) использовалась модель гексагональной упаковки молекул в монослое (глава 7), состоящего из белковых глобул, каждая молекула которого взаимодействует с шестью соседними. Полученное значение силы взаимодействия составило 113 ± 24пН, что близко к значению силы (FT4=64±16 пН), которую необходимо приложить к агрегату, состоящему из не скольких мономеров лизоцима T4 для того, чтобы разорвать связь между 21 и остатками одного мономера.

В главе 6 рассмотрена модель колебаний балки, закрепленной с одного конца, в свободном колебательном состоянии. Модель позволят численно рассчитывать изменения собственной частоты кантилевера при изменении массы, сосредоточенной на его незакрепленном конце.

Глава 7 содержит новый метод оценки сил парных взаимодействий соседних белковых глобул в монослойной пленке, иммобилизованной на поверхности кантилевера, с учетом принятия допущения о структуре пленки. В данной модели рассматривается плотнейшая гексагональная упаковка белковых молекул на поверхности кантилевера (рис. 20).

Рис. 20. Модель плотнейшей гексагональной упаковки монослоя белка на поверхности кантилевера. Стрелками указаны направления действия сил межмолекулярных взаимодействий и результирующей силы, влияющей на поверхностное натяжение белковой пленки.

Результирующая сила взаимодействия Fрез, приходящаяся на одну молекулу белка и представляющая собой суммарный вклад со стороны двух соседних молекул в эффективное поверхностное натяжение (рис. 20), рассчитывается по формуле Fрез = d, (1) где d – характерный линейный размер (диаметр) молекулы, – поверхностное натяжение монослойной пленки. При расчете силы взаимодействия двух молекул Fучитывалось, что при образовании плотнейшего монослоя, состоящего из белковых глобул, каждая молекула взаимодействует с шестью соседними. Из принятой модели плотнейшей гексагональной упаковки следует, что результирующая сила Fрез может быть разложена по базису сил парных взаимодействий молекул (рис. 20), тогда Fрез F2 =. (2) 2 cos( / 6) В главе 8 на основе мирового экспериментального опыта и новых данных атомно-силовой микроскопии белковых фибрилл, полученных в данной работе, предложена модель, описывающая механизм организации ковалентно иммобилизованных молекул на подложке в фибрилы.

Рис. 21. Качественная модель образования фибрилл в монослое гексагонально упакованных белковых молекул. а) Трехмерная модель, б) двумерная модель сечения фибриллы.

Если считать молекулы сферами, прикрепленными к поверхности за один линкер (рис. 21б), то, опираясь на данные атомно-силовой микроскопии поверхности монослоя лизоцима на золоте, содержащего фибриллы (рис. 19б), можно предположить, что в процессе агрегации происходит изменение конформации молекулы белка таким образом, что одна ее часть переходит непосредственно в фибриллу, а другая, находящаяся в частично денатурированном состоянии, остается вне ее жесткого стержня.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»