WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Во введении отмечается актуальность темы диссертационной работы, определяются ее цели и задачи.

Глава 1 содержит обзор литературы по теме диссертации. В обзоре кратко представлены основы методов зондовой микроскопии, в особенности атомносиловой микроскопии (раздел 1.1.1) и силовой спектроскопии (раздел 1.1.2), и их применения при исследовании свойств биополимерных систем. В разделе 1.1.3 рассматриваются аспекты функционирования современных перспективных микрокантилеверных устройств в качестве высокочувствительных многофункциональных биохимических датчиков. Проанализированы основные факторы, отвечающие за выработку аналитического сигнала микрокантилеверных сенсоров. Представлен спектр применений микромеханических систем и схем регистрации аналитического сигнала (раздел 1.3), при этом особое внимание уделено анализу супрамолекулярных структур рецепторных слоев силовых преобразователей. В обзоре также кратко описаны основные характеристики и принципы функционирования распространенных преобразователей биофизических реакций в аналитический сигнал (раздел 1.2).

Изложение результатов диссертации логически разделено на две части: экспериментальную (главы 2 – 5) и теоретическую (главы 6 – 8).

Глава 2 содержит описание разработки и конструкторской сборки научного прибора на основе атомно-силового микроскопа (раздел 2.2), предназначенного для исследования физико-химических свойств тонких пленок и микрообъектов, помещенных на поверхность кантилевера (рис. 1б).

Рис. 1. а) Сборка жидкостной ячейки, содержащей кантилевер. б) Универсальная микрокантилеверная сенсорная система.

В цель работы входило проведение калибровки и тестирования комплекса и создание оптимальных методов закрепления объектов исследования на поверхности кантилевера.

0 10 20 30 40 50 60 Присоединенная масса, нг Рис. 2. Изображение кантилевера с пят- Рис. 3. Зависимость резонансной частоты балки надцатью полистирольными микроша- кантилевера от изменения массы на ее конце при риками, прикрепленными к его концу с последовательном прикреплении калибровочных помощью эпоксидного клея.

микросфер. Сплошная кривая – теоретический расчет.

Ошибка метода измерения массы микрообъектов с помощью кантилеврера оценивалась на основе сопоставления экспериментальных данных и теоретического расчета массы (глава 6) последовательно, одна за другой, взвешиваемых полистироловых микрошариков (рис. 3), закрепляемых на свободном конце кантилевера «Nanosensors» эпоксидным клеем (рис. 2). Эта ошибка, обусловленная дисперсией локализации частиц на поверхности кантелевера, не превышала 5%. Достигнутая разрешающая способность измерения массы одиночных объектов составила 1 пг (что сравнимо с массой одной бактериальной клетки E-coli) и на порядок превзошла чувствительность традиционного метода кварцевого микровзвешивания.

В разделе 2.3.3 проанализированы артефакты метода микровзвешивания, связанные с температурными градиентами в измерительной системе и флуктуациями Частота кантилевера, кГц плотности (влажности среды). Было установлено, что при измерении масс меньших 10-9 г во избежание теплового дрейфа и для сохранения величины ошибки не более 5% требуется поддерживать в системе стабильность температуры (колебания температуры не должны превышать 1 °С). Флуктуации влажности среды также значительно ухудшают стабильность микровзвешивающей системы. В связи с этим на примере кантилеверов CSC12(E) было показано, что микрорезонансные системы можно использовать в качестве измерителей влажности среды. Для устранения перечисленных артефактов была разработана герметичная ячейка (рис. 1а), обеспечивающая необходимую стабильность температурных и диссипационных вкладов в ошибку измерений.

С помощью резонансной кантилеверной системы были исследованы микрочастицы силикагеля с поверхностью, модифицированной гидрофобными углеводородными молекулами, для изучения сорбции паров толуола. Результаты измерений сорбции паров толуола частицами сорбента диасорб-60-С16, закрепленными на конце кантилевера, представлены на графике зависимости массы паров растворителя поглощенных частицей частице сорбента, от массы самой частицы (рис. 4).

Зависимость массы поглощенных паров от массы частицы Рис. 4. Зависимость массы адсорбированных паров толуола на поверхности частиц диа0 50 100 150 200 сорб-60-С16 от массы самих частиц сорбента.

Масса частицы сорбента, нг Кантилевер с прикрепленной частицей диасорб-60-С16 массой 78,6±4,9 нг (справа).

Из рисунка 4 видно, что кривая, проведенная через экспериментальные точки зависимости поглощенной массы паров m от массы частиц силикагеля M, отлична от зависимости m ~ M2/3 для частицы, имеющей гладкую поверхность, как у микросфер изображенных на рис. 2. В случае монослойной сорбции для сорбента с максимальной фрактальной размерностью D = 3 изменение массы частицы m ~ MX, где Х = 1. В зависимости, показанной на рис. 4, степенной коэффициент X > 1, что может говорить о лучшей способности частиц с большей массой к мультислойной паров, нг Масса поглощенных сорбции, очевидно, обусловленной замедлением диффузии молекул сорбата во внутренних порах крупной частицы.

Метод резонансного микровзвешивания с использованием кантилевера позволяет оценить кинетические коэффициенты сорбции и десорбции паров, которые стоят в показателе экспоненты решения уравнения Ленгмюра: kсорб=kd+kaC. В случае десорбции концентрация сорбата над поверхностью близка к нулю и kсорб = kd.

1,Десорбция частицей толуола Десорбция частицей этанола 0,Чистый кантилевер в парах толуола Рис. 5. Кинетические кривые 0,десорбции паров этанола и паров толуола с поверхности час0 100 200 300 400 500 600 700 800 тицы диасорб-60-С16.

-0,Время, с Различие сорбционных характеристик частицы диасорб-60-С16 при поглощении паров толуола и этанола объясняется тем, что модифицированная поверхность данного сорбента сорбирует молекулы полярных растворителей (спиртов, ацетона, воды) хуже, чем неполярных (толуол, бензол, хлороформ) (см. рис. 5). Коэффициент десорбции, зависящий от энергии связи молекулы сорбата с адсорбентом, для этанола оказался большим, чем для толуола, что подтверждает гидрофобность модифицированного силикагеля.

Глава 3 посвящена применению разработанной микрокантилеверной системы (раздел 2.2) для исследования свойств самоорганизующегося рецепторного слоя молекул бис-4-(2пиридилметиленаминофинил)дисульфида Рис.6. Вверху: схема химической реакции бис(лиганда), способных образовывать хелат4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида с золотой подложкой. Внизу: реакция ный комплекс с ионами двухвалентных обратимого образования металлокомплекса.

металлов: Co2+, Ni2+, Cu2+, как показано на рис. 6. Обратимое разрушение образовавшихся металлокомплексов в слое молекул лиганда осуществлялось посредством инкубации кантилевера в водном растворе соляной кислоты (10-2 М), которая производилась в течение 1 часа.

Масса сорбированных паров, нг Хемосорбция лиганда на золотой стороне кантилевера сопровождалась изгибом балки в сторону растущего монослоя (рис. 7), т.е. наблюдался эффект увеличения поверхностного натяжения. Данные по изменению краевого угла смачивания капли воды на золотой отклонение кантилевера при сорбции лиганда (0,001М) подложке в зависимости от нормированное изменение краевого угла 0,смачивания при сорбции лиганда (0,001М) времени ее инкубации в 0 2 4 6 8 10 растворе лиганда (10-3М) -0,-0,соответствуют результатам, -0,полученным с помощью -0,микрокантилеверной сис-0,темы (рис. 7), которые го-0,Время протекания процесса, ч ворят о том, что за 8 – часов на золотой поверхноРис. 7. Хемосорбция лиганда 10-3 М из метанола на золотую поверхность. Данные изгиба кантилевера – сти из раствора лиганда обверхняя кривая. Нормированное изменение краевого разуется плотно упакованугла смачивания капли воды на золотой подложке, модифицированной лигандом, с течением времени – нижный слой молекул.

няя кривая. Направление изгиба кантилевера показано на вставке.

При помещении кантилевера в водный раствор, содержащий ионы Co2+, наблюдался его значительный изгиб в сторону немодифицированной кремниевой поверхности (рис. 8а). Данное поведение системы обуславливалось увеличением зарядовой плотности рецепторного слоя за счет привнесения ионов атомов двухвалентных металлов, которые вместе с молекулами лиганда, иммобилизованными на золотой поверхности, образуют хелатные комплексы (рис. 6). После инкубации кантилевера в водном растворе соляной кислоты (10-2 M) наблюдалась его релаксация в исходное состояние, в котором он находился до момента помещения в раствор соли (рис. 8б). Таким образом, с помощью метода измерения силового изгиба кантилевера была подтверждена обратимость реакции образования металлокомплекса (см. рис. 6). Повторное помещение кантилевера в раствор соли вызывало отклик системы, аналогичный наблюдавшемуся в предыдущем цикле эксперимента (рис. 8в).

Поверхностное натяжение,Н/м С понижением концентрации ионов кобальта в растворе величина деформации кантилевера 0,уменьшалась, а a б в 0,Рис. 8. Кинетика изгиба при концентрации кантилевера при после0,довательной инкубации 0,10-7М соотношев водных растворах: а) 0,Co(ClO4)2·6H2O (кон- ние сигнал/шум 0,центрация 10-3М), б) составляло HCl и в) Co(ClO4)2·6H2O 0 50 100 150 200 250 300 350 (концентрация 10-3М).

Время протекания процесса, мин 2,3 ± 0,1, что близко минимальному обнаруживаемому сигналу. Таким образом, можно заключить, что предельная концентрация обнаружения ионов кобальта в воде для описанной системы составляла порядка 10-7 М.

Конкурирующим фактором для сил электростатического отталкивания являются конформационные изменения молекул при образовании металлокомплексов. В случае ионов Co2+ проявляется явное доминирование электростатических сил отталкивания, создающих в слое избыточное давление. На рисунке 9 показаны отклики кантилевера на первичный цикл инкубации в водном растворе (10-3 M) солей двухвалентных металлов MX2·6H2O (где M – Co, Cu, Ni; X – ClO4). Наибольший силовой отклик соответствует нахождению кантилевера в водном растворе соли кобальта, а наименьший – в растворе соли меди. По данным электронной спектроскопии комплексов бис-4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида с ионами Co(ClO4)2 6H2O (0,001M) 0,Ni(ClO4)2 6H2O (0,001M) Рис. 9. Кинетика изгиба канCu(ClO4)2 6H2O (0,001M) 0,тилевера при инкубации в 0,водных растворах: MX2·6H2O 0,(M – Co, Cu, Ni; X – ClO4) (цикл 1, концентрация 10-3М).

0,В правой части рисунка изо0,бражены соответствующие формы комплексов.

0 10 20 30 40 50 60 70 -0,Время протекания прорцесса, мин металлов было показано, что комплексы с никелем имеют форму плоского квадрата, комплексы с кобальтом – тетраэдральную форму, а форма комплекса с медью не может быть определена однозначно на основе электронного спектра. Таким образом, можно заключить, что степень отклика кантилевера при комплексообразовании Поверхностное натяжение,Н/м Поверхностное натяжение,Н/м непосредственно зависит также от формы комплекса, определяемой величиной затраченной энергии.

Глава 4 содержит результаты исследования реакций афинного взаимодействия макромолекул антител на поверхности кантилевера со специфическими антигенами двух типов – гаптеном Рис. 10. Схема конкурентного иммуноанаи высокомолекулярным лиза: А) кантилевер с белком, вследствие чего монослойной пленкой антигенов; Б) адсорбразбита на две части. В разция антител на специфическую рецепторделе 4.1 предложен протоную поверхность кантип анализатора опиатных тилевера, содержащую антиген; В) десорбция препаратов, работающего антител с поверхности под действием молекул по конкурентной схеме антигена.

(рис. 10), аналитом для ко- торого являлся морфин. В настоящей работе химическая иммобилизация антигена производилась посредством его ковалентного конъюгирования с овальбумином и последующей прививки конъюгата к поверхности кантилевера для сохранения иммуногенных свойств морфина (рис. 10а). В соответствии с конкурентной схемой анализа (рис. 10) для получения на поверхности кантилевера иммунных комплексов проводилась адсорбция антител на привитый конъюгат. Адсорбция антител кролика на поверхности кантилевера, содержащей морфин, сопровождалась изгибом балки в сторону рецепторного слоя (рис. 12). Такое поведение системы объясняется стремлением антител связать, по меньшей мере, две соседние молекулы конъюгата на поверхности, что вызывает эффективное натяжение белкового слоя. Этот факт был подтвержден также данными атомно-силовой микроскопии (рис. 11). При контакте гидрофобизированной поверхности слюды, модифицированной физически сорбированным конъюгатом морфин-овальбумина (рис. 11а), с антителосодержащей сывороткой было замечено возникновение агрегированных каплевидных образований (рис. 11б), которые свидетельствуют о том, что молекулы антител, связываясь с конъюгатом, инициируют поверхностное натяжение в белковой пленке.

Рис. 11. а) Слой конъюгата а б на поверхности гидрофобизированой слюды после многократной промывки в фосфатном буфере (ФБ) (размер изображения 2,8х2,мкм). б) Слой конъюгата на поверхности гидрофобизированой слюды после контакта с разбавленной в ФБ сывороткой крови со специфическими антителами (размер изображения 2,8х2,мкм).

Как видно из рис. 12, при сорбции антител из сыворотки крови кролика с разбавлением 1:150 кривая сорбции 0,удовлетворяет экспоненциальной Степени разбавления исходной сыворотки крови аппроксимации уравнения Лен- -0,иммунизированного кролика -0,гмюра и выходит на насыщение за -0, 70–80 минут. При повышенных -0, концентрациях сыворотки (1:50) -0,-0,из-за сильных флуктуаций интен0 10 20 30 40 50 60 70 Время протекания процесса, мин сивности, связанных с оптической Рис. 12. Сорбция антител на поверхность кантинеоднородностью раствора, шум в левера, содержащую конъюгат овальбумина с морфином.

системе увеличивался, но сила изгиба кантилевера оставалась прежней. Данные результаты говорят о том, что кантилевер с иммобилизированным антигеном можно использовать в качестве теста, позволяющего анализировать плазму крови на предмет содержания в ней специфических антител, при диагностике различных заболеваний или допинг-теста.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»