WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Киселев Глеб Александрович ИЗУЧЕНИЕ СЕНСОРНЫХ СВОЙСТВ ОРГАНИЧЕСКИХ И ПОЛИМЕРНЫХ ПЛЕНОК НА ТВЕРДОЙ ПОДЛОЖКЕ Специальности 02.00.06 – высокомолекулярные соединения, 01.04.07 – физика конденсированного состояния

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2007

Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант:

доктор физико-математических наук, профессор Яминский Игорь Владимирович

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор Гиваргизов Евгений Инвиевич Кандидат физико-математических наук Прохоров Валерий Васильевич

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт физических проблем им. Ф.В. Лукина

Защита состоится « 25 » апреля 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 501.002.01 в Московском государственном университете им.

М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет, ауд. _

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан « » _ 2007г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 501.002.01 кандидат физико-математических наук Лаптинская Т.В.

2

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Многие процессы, протекающие в тонких органических и полимерных слоях в настоящий момент недостаточно изучены в силу ограниченных возможностей большинства косвенных методов анализа свойств тонких пленок. При этом знания об энергетических причинах самоорганизации субьединиц монослоев и сил кооперативных взаимодействий биополимеров вблизи поверхности являются насущной необходимостью в областях сенсорных приложений, биосовместимых материалов и медицинских приборов, контактирующих с физиологическими жидкостями, таких как зонды, протезы, контактные линзы и т.д. Подобная задача актуальна также в исследованиях механизмов агрегации биополимеров в клеточных мембранах, приводящих к нарушениям ионного обмена и нейродегенеративным заболеваниям человека.

Благодаря использованию современных микрокантилеверных преобразователей поверхностных реакций совместно с методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) становится возможным получение более полной информации о морфологии и энергетических свойствах монослойных пленок, с чем связан интенсивный рост числа публикаций по данной тематике в ведущих научных журналах.

Появление кантилеверов во многом обусловлено интенсивным развитием атомно-силовой микроскопии. Устройства с микромеханическими преобразователями зарекомендовали себя в качестве полноценного научного инструмента, применяемого в исследованиях межмолекулярных взаимодействий в монослойных пленках низкомолекулярных веществ, биополимерных объектов, а также в областях химии поверхностных реакций, биологии и медицине. Существенной особенностью кантилевера, не имеющей альтернативных аналогов, является способность прямого измерения натяжения в пленках, помещенных на одну из его сторон. Благодаря этому информация о состоянии исследуемых объектов, получаемая с помощью микромеханических систем, оказывается уникальной и, вообще говоря, отличается от той, которую дают распространенные методы анализа массы, а также оптических, и электрических свойств пленок. Уникальность информации состоит в том, что она непосредственно характеризует энергию межмолекулярных взаимодействий внутри пленки, преобразующуюся в статический изгиб кантилевера (энергию аналитического сигнала).

Основной целью диссертационной работы являлось получение новых экспериментальных данных с использованием зондовой микроскопии и микрокантилеверных систем о свойствах самоорганизующихся монослойных пленок сераорганических соединений, иммунных комплексов и белков, иммобилизованных на твердой подложке, и разработка методики иммобилизации биополимеров на поверхности кантилевера. Методическая часть работы включала в себя также разработку научного прибора на основе атомно-силового микроскопа, позволяющего прецизионно измерять массу микрообъектов и латеральные напряжения в тонких пленках, помещенных на поверхность кантилевера. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи исследования.

1. Выявить и охарактеризовать основные механизмы, инициирующие аналитический сигнал деформаций микрокантилеверного преобразователя при комплексации ионов двухвалентных металлов в рецепторном слое молекул бис4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида на примере самоорганизующихся монослоев сурфактантов: тиофенола, 4-аминотиофенола и гексантиола.

2. Разработать методику ковалентной и физической иммобилизации биополимеров на кремниевой и золотой поверхностях кантилевера. Исследовать морфологию рецепторных слоев прямых биополимерных кантилеверных анализаторов морфина и высокомолекулярного антигена – пероксидазы хрена (ПХ). Изучить механизмы, отвечающие за возникновение поверхностного натяжения в рецепторной пленке при различных методах иммобилизации молекул IgG в рецепторе.

3. С помощью АСМ исследовать процессы образования фибрилл лизоцима при низких pH из монослойных пленок на модифицированных гидрофильной и гидрофобной поверхностях. Изучить кинетику и измерить абсолютные значения сил изгиба кантилевера на примере молекул лизоцима, привитых на золотой и кремниевой сторонах кантилевера. Построить схему расчета сил парных взаимодействий соседних белковых звеньев, находящихся на поверх ности кантилевера, исходя из данных о величине изгиба кантилевера и о структуре монослойной пленки.

4. Разработать методику закрепления микрочастиц и реализовать метод измерения их массы с использованием кантилевера атомно-силового микроскопа в резонансном режиме. Провести сопоставление модельных и экспериментальных результатов определения массы с помощью кантилевера для оценки относительной погрешности измерения массы и разрешающей способности разработанной системы микровзвешивания. Исследовать индивидуальные сорбционные свойства одиночных микрочастиц хроматографического сорбента (силикагеля с модифицированной поверхностью).

Материалы и методы. Измерения проводились на атомно-силовом микроскопе ФемтоСкан (Центр перспективных технологий, Россия) в режиме прерывистого контакта на воздухе с использованием кантилеверов NSC14 (MikroMasch, Россия) из кремния с номинальной жесткостью 5 Н/м и резонансной частотой сканирования в диапазоне 150–170 кГц. Обработка изображений осуществлялась с помощью программы ФемтоСкан Онлайн (Центр перспективных технологий, Россия).

В качестве подложек для образцов были выбраны свежесколотые с золотым напылением (напылитель Eiko IB-3) и подвергнутые различным модификациям поверхности слюды. В качестве модификатора слюды (кремния в случае кантилеверов), аминирующего поверхность, использовался 3-аминопропилсилатран (АПС), для аминирования золотой поверхности – 4-аминотиофенол. Модификация аминированных поверхностей для последующей иммобилизации белков производилась с помощью глутарового альдегида. Остаточные альдегидные группы блокировались трис-(гидроксиметиламинометаном).

Измерение сил в пленках и массы на поверхности микрокантилеверов осуществлялось с помощью разработанного в рамках данной работы устройства, тестирование которого для экспериментов прецизионного контроля массы проводилось с использованием полистироловых калибровочных микросфер и пьезосканера атомно-силового микроскопа. Диаметр полистироловых микросфер определялся на растровом электронном микроскопе (HITACHI S-520). Для измерения массы использовались кантилеверы Nanosensors c резонансной частотой 320 кГц и жесткостью Н/м. При измерении сил в тонких пленках применялись кремниевые консоли fpC жесткостью 0,03 Н/м (изготовленные в Государственном научно-исследовательском институте физических проблем им. Ф.В. Лукина, Москва).

Иммобилизация белков на поверхности кантилеверов и образцов для АСМ проводилась в одинаковых условиях путем непосредственного контакта поверхности и буфера с модификатором.

Конъюгат морфин-овальбумин, сыворотка крови кролика, содержащая специфические антитела к морфину, растворы морфина были предоставлены сотрудниками Института физиологически активных веществ (ИФАВ). Эксперименты с данными веществами проводились на территории ИФАВ.

Иммобилизатор IgG – белок А, пероксидаза хрена (ПХ), анти-ПХ-IgG кролика, бычий сывороточный альбумин (БСА) и овальбумин были предоставлены сотрудниками кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ им.

М.В. Ломоносова.

Низкомолекулярные сурфактанты (4-аминотиотиофенол, гексанотиол, тиофенол, бис-4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфид, 3-аминопропилсилатран, трис-(гидроксиметиламинометан), глутаровый альдегид), буферные солевые растворы (фосфатный (pH = 7,0), ацетатный (pH = 4,5), глициновый (рН = 3,0)), растворы солей (MX2·6H2O, где M – Co, Cu, Ni и X – ClO4) были предоставлены сотрудниками кафедр органической химии, химии нефти и органического катализа химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научная новизна диссертации.

1. Установлен факт увеличения поверхностного давления в самоорганизующейся пленке молекул бис-4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида (лиганда), иммобилизованной на поверхности кантилевера, вследствие возрастания электростатической плотности в пленке в результате комплексации ионов Co2+, Ni2+, Cu2+ с молекулами лиганда. Показана обратимость реакции образования хелатных комплексов в рецепторе. Обнаружено различие в значениях поверхностных сил при комплексации ионов Co2+, Ni2+, Cu2+ в слое лиганда, связываемое с тем, что энергии образования соответствующих хелатных комплексов отличаются друг от друга.

2. Разработаны методики ковалентной и физической иммобилизации белков на кремниевых и золотых поверхностях кантилевера. Впервые реализованы высо коселективные микрокантилеверные анализаторы на основе биополимерной пары – пероксидазы хрена и IgG – с чувствительностью к нескольким наномолям аналита в 1 л буферного раствора. Показано, что конформационные изменения молекул IgG при связывании с пероксидазой генерируют аналитический сигнал деформаций кантилевера, характеризующий уменьшение энтропии макромолекулярных комплексов.

3. Впервые реализован контроль селективной реакции определения морфина на поверхности кантилевера. Установлено, что причиной деформаций кантилевера при диссоциации комплексов морфин-IgG на его поверхности является спонтанное снятие напряжения в рецепторной пленке, которое сообщалось системе при иммобилизации молекул IgG в рецепторе.

4. Обнаружен катализ роста фибрилл лизоцима из химически иммобилизованного монослоя на поверхностях золота и слюды при pH = 3,0. Впервые получены данные по морфологии и размеру фибрилл лизоцима, выросших из монослоя химически иммобилизованых молекул белка. С помощью микрокантилеверной системы проведены измерения сил в пленках привитого лизоцима на гидрофобных и гидрофильных поверхностях кантилевера при «кислом» значении pH = 3,0.

Обнаружена корреляция между скоростями процессов роста фибрилл из монослоев на гидрофильных и гидрофобных подложках и развитием сил в пленке белка на данных поверхностях.

5. Предложена качественная модель, объясняющая возможность образования фибрилл из молекул белка, находящихся на поверхности в связанном состоянии.

6. Предложена схема расчета парных взаимодействий соседних белковых звеньев, находящихся на поверхности кантилевера, на основе данных о величине изгиба кантилевера и структуре монослойной пленки. Экспериментально определены силы парных взаимодействий молекул лизоцима в монослое на поверхности кантилевера.

7. Разработана методика закрепления микрочастиц на поверхности кантилевера и реализован метод измерения их массы с помощью кантилевера атомно-силового микроскопа в резонансном режиме. Впервые охарактеризованы сорбционные свойства одиночных микрочастиц хроматографического сорбента диасорб-60С16 к парам полярных и неполярных растворителей.

Практическая значимость работы. Результаты диссертации позволяют продвинуться в решении следующих задач:

- исследовании кооперативных взаимодействий в биополимерных пленках;

- разработке новых методов исследования массовых свойств микрообъектов;

- создании новых прямых методов иммунохимического анализа на базе микроэлектромеханических систем;

- создании высокочувствительных сенсоров на ионы металлов в жидкостях, разработка ионоселективных электродов;

- создании методов диагностики и профилактики нейродегенеративных заболеваний животных и человека, вызванных прионными патогенными белками.

Следует отметить, что результаты диссертации могут быть полезны в физике биополимеров, биофизике, молекулярной биологии и медицине.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях:

- Международный симпозиум «Молекулярный дизайн и синтез супрамолекулярных архитектур», Казань, 2004.

- Международная конференция «Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy and Related Techniques in conjunction with 13th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy», Sapporo, Japan, 2005.

- Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Москва, 2005.

- Международная конференция «Малый полимерный конгресс», Москва, 2005.

- Международная конференция «Биотехнология и медицина», Москва, 2006.

- Международная конференция «International Conference on Nanoscience and Technology 2006», Swisserland, Basel, 2006.

- Всероссийская конференция (с международным участием) «Химия поверхности и нанотехнология», Санкт-Петербург, 2006.

- «Четвертая всероссийская каргинская конференция», Москва, Россия, 2007.

Личный вклад автора. Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии проведены автором. Все образцы приготовлены автором лично (за исключением синтеза химических веществ). Разработка многофункционального научного из мерительного комплекса и проведенные на нем измерения выполнены автором лично. Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, заключения, списка литературы, включающего 203 наименования. Работа изложена на 138 страницах, содержит 74 рисунка и 9 таблиц.

Основное содержание работы

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»