WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Методом обратной полимеразной цепной реакции проводилась оценка уровня экспрессии генов, кодирующих белки семейства Rpf в процессе перехода M. smegmatis в НК состояние в динамике. Параллельно исследовалась активно растущая культура M. smegmatis (Рис. 14). Для проведения обратной полимеразной цепной реакции использовали специфические праймеры для генов rpf A, B, C, F.

Транскрипты всех четырех генов присутствуют в метаболически активной культуре (справа на электрофореграмме), причем для rpf B характерно снижение уровня транскрипции в стационарной фазе в случае активной культуры. Для культуры, рост которой происходит с образованием некультивируемых форм (на электрофореграмме слева), rpf B отсутствует даже на ранних стадиях, для остальных белков Rpf транскрипты в НК клетках обнаруживаются, но наблюдается снижение их количества по мере уменьшения числа КОЕ. Таким образом, наблюдается снижение уровня экспрессии всех четырех Rpf-подобных генов при переходе клеток M. smegmatis в НК состояние. Однако для rpfА и rpfС при полном падении способности культивироваться – точки 72 часа, или три для – содержалось некоторое количество транскриптов в клетках. Однако по результатам транскриптомного анализа было выявлено, что для клеток, находящихся в НК состоянии повышался уровень экспрессии для Rpf B - в 5,5 раз и для Rpf C – более чем в 11 раз. Данный результат, по-видимому, свидетельствует о том, что уровень транскрипции для состояния «некультивируемости» и фазы начала перехода в НК состояние в случае гена rpf A остается на прежнем уровне, а для гена rpf B в НК состоянии наблюдается некоторая активация, не выявляемая методом ОТ-ПЦР. По всей вероятности, продукты генов rpf B, C, и вероятно, rpf A, принимают важное участие в процессе оживления НК клеток M. smegmatis.

rpf A rpf B 1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 rpf C rpf F 1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 Рис. 14. ОТ-ПЦР анализ уровня экспрессии генов, кодирующих белки семейства Rpf M. smegmatis при росте с образованием НК клеток: дорожки 1 – 24 ч, 2 - 48 ч, 3 – 72 ч, 4 - 96 ч, 5 – 120 ч, и в активнорастущей культуре, дорожки 6 – 24 ч, - 48 ч, 8 – 72 ч, 9 - 96 ч, 10 – 120 ч. M – маркеры длины фрагментов ДНК (п.н.).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несмотря на многочисленные попытки воспроизвести латентное состояние туберкулезной инфекции in vitro, существует ограниченное число моделей, достаточно адекватно имитирующих явление персистенции в живых организмах.

Необходимыми критериями для признания таких моделей адекватными являются:

обратимость покоящегося состояния клеток, формирование НК фенотипа в состоянии покоя, сниженный уровень метаболизма. Кроме того, достаточно важным аспектом представляется возможность получения покоящихся клеток M.

tuberculosis без ограничения в концентрации кислорода, что более физиологично для микобактерий, являющихся аэробами, а также целесообразно по причине отсутствия убедительных доказательств того, что при попадании в организм хозяина микобактерии туберкулеза испытывают недостаток кислорода.

Разработанная и оптимизированная в ходе данной работы модель получения НК клеток M. smegmatis – быстрорастущего непатогенного родственника M.

tuberculosis - при росте в стационарной фазе является достаточно удобной для исследований и хорошо воспроизводимой. Она удовлетворяет всем перечисленным выше критериям и, как предполагается, может рассматриваться как модель персистирующей туберкулезной инфекции in vivo.

Модель получения НК клеток непосредственно с участием возбудителя туберкулеза – бактерии M. tuberculosis, разработанная в ходе настоящего исследования, представляет особый интерес и может считаться уникальной, поскольку в мировой литературе до сих пор не упоминалось M. tuberculosis о возможности получения НК клеток M. tuberculosis в аэробных условиях в стационарной фазе.

По результатам транскриптомного анализа клеток M. smegmatis в НК состоянии можно сделать вывод, что процесс перехода в состояние «некультивируемости» является не недетерминированным процессом деградации клеток, а особой стратегией существования, сопровождаемой активацией ряда генов, что позволяет рассматривать его как активный, программируемый процесс. Подобный результат согласуется с накопленными на сегодняшний момент данными о механизмах туберкулезной латентности.

На сегодняшний момент можно считать установленной ведущую роль белков Rpf в реактивации НК клеток. Очевидно, реактивирующая роль Rpf, как показано в данном исследовании, обусловлена литической способностью в отношении пептидогликана, приводящей к модификации и разрыхлению утолщенной клеточной стенки НК бактерий и обеспечивающей поступление питательных веществ внутрь клеток с последующей инициацией процесса пробуждения.

ВЫВОДЫ 1.Найдены условия для получения «некультивируемых» клеток M. smegmatis и M. tuberculosis при росте в длительной стационарной фазе в аэробных условиях.

2.«Некультивируемые» формы M. smegmatis характеризуются сниженным уровнем дыхательной активности и активности ряда ферментов, что является результатом торможения метаболических процессов и уменьшения концентрации внутриклеточных субстратов.

3.Переход клеток M. smegmatis в «некультивируемое» состояние сопровождается повышенным уровнем экспрессии ряда генов, продукты которых принимают участие в анаболических процессах, что позволяет рассматривать его как активный, генетически программируемый процесс.

4.Реактивирующее действие белков семейства Rpf в отношении «некультивируемых» клеток микобактерий связано с их литической активностью в отношении компонентов бактериальной клеточной стенки, а именно, их способностью гидролизовать -1-4-гликозидные связи пептидогликана.

5.Уровень продукции белков Rpf у микобактерий очень низок (менее 10 пг/мл супернатанта в стационарной фазе), что подтверждает предположение об их регуляторной роли.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи 1.Салина Е.Г., Шлеева М.О., Капрельянц А.С. (2005) Образование покоящихся («некультивируемых») форм Мycobacterium smegmatis и их характеристика. Сборник статей «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», Саратов, изд-во «Научная книга» с. 156-162.

2.Mukamolova, G.V., Murzin, A.G., Salina, E.G., Demina, G.R., Kell, D.B., Kaprelyants, A.S. and Young, M. (2006). Muralytic activity of Micrococcus luteus Rpf and its relationship to physiological activity in promoting bacterial growth and resuscitation. Molecular Microbiology. 59(1), p.84-98.

3.Телков М.В., Демина Г.Р., Волошин С.А., Салина Е.Г., Дудик Т.В., Стеханова Т.Н., Мукамолова Г.В., Казарьян К.А., Гончаренко А.В., Янг М., Капрельянц А.С. (2006) Белки семейства Rpf (Resuscitation promoting factor) являются пептидогликангидролазами. Биохимия. Т.71 №4. С.514-524.

4.Салина Е.Г., Вострокнутова Г.Н., Шлеева М.О., Капрельянц А.С. (2006) Роль межклеточных взаимодействий при образовании и реактвации «некультивируемых» микобактерий. Микробиология. Т.75, №4, С.502-508.

Тезисы конференций 1.Шлеева М.О., Салина Е.Г., Капрельянц А.С. (2004). Рост Mycobacterium smegmatis в неоптимальных условиях приводит к образованию «некультивируемых» (покоящихся) клеток. 8-я школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 17-21 мая, с. 2.Салина Е.Г., Шлеева М.О., Капрельянц А.С. (2004). Образование покоящихся («некультивируемых») форм Мycobacterium smegmatis и их характеристика. 2-я региональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», Саратов, 26-28 октября, с. 3.Salina E.G., Shleeva M.O., Vostroknutova G.N., Kaprelyants А.S. (2005).

“Non-culturability” of Mycobacterium smegmatis in stationary phase. 15th European Соngress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Copenhagen, Denmark, 2-April, р. 4.Salina E.G., Demina G.R., Mukamolova G.V., Young M., Kaprelyants A.S.

(2006). Peptidoglycan hydrolase activity of proteins of the Rpf family and its relatationship to resuscitation of “non-culturable” cells. 2nd FEMS Congress of European Microbiologists, Spain, Madrid, July 4-8, p. 173.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»