WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Интересно, что уровень экспрессии ряда генов бактерии M. smegmatis в НК состоянии оказался повышенным. Так, было выявлено 168 генов, уровень транскрипции которых в состоянии «некультивируемости» (72 ч) превышал уровень транскрипции в клетках, находящихся в начале перехода в НК состояние (56 ч) в 2 и более раза. В целом, количество положительно регулируемых генов составляет около 2.5% от всего генома M. smegmatis, насчитывающего 6892 генов (Рис. 11). Падение экспрессии в 2 и более раза в состоянии «некультивируемости» по сравнению с начальной фазой этого процесса – точкой 56 ч отмечалось для генов. Остальные гены не изменяли существенно свой уровень экспрессии или же не давали согласованного результата в двух повторностях.

Гены с пониженным уровнем транскрипции Гены, уровень транскрипции которых повышен Рис. 11. По результатам транскриптомного анализа, 2.5% генов M. smegmatis характеризуются повышенным (>2) уровнем экспрессии в НК состоянии.

При рассмотрении генов, характеризующихся повышенным уровнем транскрипции в состоянии «некультивируемости» (72 часа роста) по сравнению с фазой начала перехода в НК состояние, с более жестким критерием – 5, было выявлено 57 таких генов. Поскольку геном M. smegmatis изучен не в достаточной степени, и продукты значительного числа генов не известны, анализировалась степень гомологии интересующих нас генов с генами M. tuberculosis (программа BLAST), по результатам делалось предсказание относительно продукта конкретного гена и его функции. В результате эти 57 генов были распределены в 10 групп в соответствии с функциями белков, кодируемых ими (Таблица 1).

Таблица 1. Распределение белков M. smegmatis, гены которых обнаружили значительно повышенный уровень транскрипции (>5) в НК состоянии в зависимости от функций, выполняемых в клетке.

Rv1158, Rv1821, Rv1859, Rv2377c, Rv3879, Rv3899c Транспортные белки Rv0845, Rv1009, Rv1267, Rv1884c, Rv3133c, Rv3327 Регуляторные белки Rv0527, Rv2344c, Rv3777 Энергетический метаболизм Rv0129c, Rv0341, Rv2934 Белки клеточной стенки Rv0310с, Rv0695, Rv1399c, Rv3813c Гидролазы Rv0165c, Rv1641, Rv3060c, Rv3246c, Rv3291c, Rv3833 Регуляция транскрипции и трансляции Rv0435c, Rv2154c Деление клеток Rv0382c, Rv1381, Rv2139 Биосинтез пиримидинов Rv0282, Rv0940c, Rv1279, Rv1895, Rv2002, Rv2266, Различные «неэнергеRv2996c, Rv3774 тические» оксидоредуктазы Rv0048c, Rv0310c, Rv0574c, Rv0735, Rv1491c, Rv1509, Rv2340, Rv2704, Rv3230, Rv3516, Rv3529c, Rv3786c, Гипотетические белки Rv3810, Rv3879c, Rv3910, Rv3922c В частности, было выявлено, что для клеток, находящихся в состоянии некультивируемости (72 часа роста), повышался уровень экспрессии по сравнению с точкой начала перехода в НК состояние (56 часов) для гена Rv1009, продуктом которого является Rpf B - в 5,5 раз и для Rpf C - продукта Rv1884c – более чем в 11, что может отражать, на наш взгляд, подготовленность НК клеток к процессу реактивации.

Таким образом, по результатам транскриптомного анализа можно сделать заключение о том, что переход клеток M. smegmatis в НК состояние не является недетерминированным процессом деградации клеток, поскольку его сопровождает активация ряда генов, принимающих участие в анаболических процессах, что позволяет говорить о нем как об активном, генетически программируемом процессе. Поэтому, несмотря на существенное падение уровня метаболической активности клеток, и, в частности активности внутриклеточных ферментов и дыхательной активности в состоянии «некультивируемости», повышение уровня транскрипции ряда генов при этом отражает, как предполагается, потенциальную жизнеспособность клеток и их готовность к последующей реактивации.

РОЛЬ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА RPF В ПРОЦЕССАХ ПЕРЕХОДА КЛЕТОК В НК СОСТОЯНИЕ И ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕАКТИВАЦИИ Взаимосвязь ферментативной активности белков семейства Rpf и их реактивирующей способности в отношении НК клеток. Полученные НК формы M. smegmatis могут быть переведены в активное, культивируемое состояние. Возможность реактивации НК форм является одним из ключевых моментов в изучении явления «некультивируемости», поскольку в этом случае наглядно демонстрируется потенциальная жизнеспособность НК форм и обратимость состояния «некультивируемости». Ранее было показано, что в процессе реактивации (или «оживления») ряда НК форм грамположительных бактерий, в том числе микобактерий, принимают участие белки семейства Rpf (Kaprelyants et al., 1994, Мукамолова и др., 1999, Shleeva et al., 2004).

Первоначально белок Rpf (от английского Resustitation Promoting Factor – фактор, ускоряющий оживление) был обнаружен у бактерии M. luteus как белок с молекулярной массой 19 кДа, секретируемый в культуральную жидкость и стимулирующий рост клеток M. luteus на обедненных средах (Mukamolova et al., 1998). Затем было обнаружено, что он обладал реактивирующей способностью в отношении покоящихся клеток M. luteus и других актиномицетов (Мукамолова и др., 1999; Shleeva et al., 2002; Shleeva et al., 2004). Для ряда организмов были выявлены гены, которые обнаружили гомологию с определенным участком гена rpf M. luteus, получившего название консервативного домена. Таким образом, можно говорить о существовании целого семейства белков Rpf, молекулярная масса которых находится в интервале от 10 до 30 кДа. У M. smegmatis было обнаружено четыре таких rpf-подобных генов, у M. tuberculosis пять. Их схематическое строение представлено на рисунке 12. Можно видеть, что три из белков M. tuberculosis (Rpf A, B, C) обладают значительным сходством с Rpfподобными белками M. smegmatis (тоже соответственно Rpf A, B, C).

Механизм реактивирующего действия белков Rpf до сих пор остаётся невыясненным окончательно. Однако недавно появились сообщения о возможном сходстве третичной структуры Rpf с таковой для лизоцима, сделанные по результатам исследований методом ЯМР (Cohen-Gonsaud et al., 2004) и теоретических предсказаний. В частности, в предсказанной модели консервативного домена Rpf имеются три альфа-спирали, пространственное расположение которых сходно с расположением альфа-спиральных участков лизоцима. Этот фрагмент молекулы Rpf, так называемый «лизоцимовый фолд», характерен и для ряда литических ферментов, участвующих в метаболизме клеточной стенки бактерий (Cohen-Gonsaud et al., 2004).

Было обнаружено, что белок Rpf проявляет литическую активность в отношении синтетического субстрата (NAG)3-MUF, специфичного для лизоцима и некоторых трансгликозилаз, а также других пептидогликангидролаз, и являющегося модельным аналогом, имитирующим фрагменты полимеров бактериальной клеточной стенки. Rpf гидролизует -1-4 связи в цепочке из трёх молекул глюкозамина в молекуле (NAG)3-MUF с образованием флуоресцирующего продукта – MUF, что прямо свидетельствует о наличии у Rpf -1-4-гликолитической активности.

M. tuberculosis M. smegmatis Rpf A Rpf A Rpf F Rpf E Rpf C Rpf D Rpf C Rpf B Rpf B 0 100 200 300 400 500 0 100 200 300 400 500 количество аминокислотных остатков количество аминокислотных остатков сигнальная последовательность консервативный домен Rpf сегмент с высоким содержанием пролина/аланина Рис. 12. Схема строения белков семейства Rpf рода Mycobacterium.

Исходя из теоретически предсказанной структуры Rpf и структуры, экспериментально полученной методом ЯМР (Cohen-Gonsaud et al., 2005), а также на основании литической активности, проявляемой в отношении пептидогликана, было сделано предположение о важности консервативного глутамата (Е54), присутствующего у всех гомологов Rpf, для катализа, поскольку он соответствует участвующему в катализе остатку глутамата у лизоцима (Е35) и литических трансгликозилаз Slt35 (Е162) и Slt70 (Е478) (Grutter et al., 1983; Thunnissen et al., 1995). Было также высказано предположение относительно важной стабилизирующей роли двух цистеиновых остатков в положении 53 и 114 в молекуле. Если это предположение верно, то аминокислотные замены в указанных положениях должны приводить к полной потере активности. Для проверки этого предположения было изучено влияние аминокислотных замен на реактивирующую способность белка Rpf – так называемую биологическую активность, и ферментативную активность в отношении синтетического субстрата (NAG)3-MUF.

Биологическую активность определяли на модели реактивации НК форм M.

smegmatis, разработанной ранее (Shleeva et al., 2004). Так, НК клетки могли быть реактивированы, если в них предварительно была введена плазмида, кодирующая синтез секреторной формы Rpf M. luteus. Клетки штамма дикого типа не обладали способностью реактивироваться в отсутствие внешних «оживляющих» факторов.

Нашими коллегами (Университет Абериствиза, Великобритания) были получены мутантные штаммы M. smegmatis, трансформированные плазмидами, кодирующими секреторную форму белка Rpf c различными аминокислотными заменами. В качестве контроля использовали реактивацию мутантных штамм M.

smegmatis при сокультивировании с клетками M. luteus (как было показано ранее, этот прием позволял реактивировать дикий тип (Shleeva et al., 2004)).

Было обнаружено, что изостерическая замена глутамата в положении 54 на глутамин приводила лишь к некоторому уменьшению способности НК клеток к реактивации (Таблица 2). Замены глутамата на менее структурно сходные аминокислоты, в частности, на аланин и особенно на лизин, вызывали значительно больший эффект подавления реактивирующей способности Rpf. Замены Сys53 и Сys114 по отдельности приводили лишь к частичному подавлению активности, в тоже время их совместная замена привела к полной потере белком Rpf реактивирующей функции. Для определения влияния аминокислотных замен в указанных положениях на ферментативную активность были использованы продуценты рекомбинантных белков Rpf, любезно предоставленные Мукамоловой Г.В. Как видно из рисунка 13, изостерическая замена консервативного глутамата в положении 54 на глутамин не привела к полной потере активности, в то время как замена на аланин и особенно лизин существенно подавляла энзиматическую активность. Максимальное ингибирование ферментативной активности проявилось у мутантной формы с заменой двух цистеиновых остатков.

Таким образом, гипотеза о пептидогликангидролазной (мурамидазной) активности Rpf и важности консервативного остатка глутамата для катализа нашла подтверждение в наших экспериментах, хотя данные сайт-направленного мутагенеза и выявили некоторые различия в механизмах катализа белка Rpf по сравнению с мурамидазами и литическими трансгликозилазами. Относительно остатков цистеина мы можем предположить, что они вовлечены либо в катализ, либо в поддержание структуры молекулы Rpf. Например, они могут участвовать в поддержании третичной структуры Rpf, необходимой для каталитической активности, за счёт дисульфидных связей (Cohen-Gonsaud et al., 2005).

Таблица 2. Реактивация «некультивируемых» клеток M. smegmatis, трансформированных плазмидой pAG, несущей ген rpf M. luteus (штамм AGR) и гены rpf с мутациями (мутантные штаммы AGX) НВЧ, кл/мл Индекс* Мутация оживления AGX AGR AGX + M. luteus Пустой < 102 1,8·107 ± 1,2·107 3,9105 ± 1,9105 <5,510-вектор E54Q 4,3104 ± 1,7104 2,3·106 ± 1,1·106 4,7106 ± 2,1106 1,910-E54A 1,1104± 0,9104 1,8·107 ± 1,2·107 3,0105 ± 2,0105 6,010-E54K < 102 1,8·107 ± 1,2·107 4,4106 ± 3,0106 <5,510-C53K 2,9104 ± 2,1104 2,3·106 ± 1,1·106 3,0106 ± 0,4106 1,310-C114T 4,0104 ± 3,5104 2,3·106 ± 1,1·106 2,8106 ± 1,6106 1,710-C53K+ < 102 1,8·107 ± 1,2·107 1,6105 ± 0,9105 <5,510-C114T Реактивация «некультивируемых» клеток, секретирующих различные мутированные формы Rpf (AGX), была определена методом конечных разведений (см. «Методы исследования»). Реактивация каждого штамма при сокультивировании с M. luteus (AGX + M. luteus) была использована в качестве положительного контроля.

*Индекс оживления рассчитывался как отношение НВЧ для AGX и AGR (дикий тип Rpf) в одном и том же эксперименте.

5 длина волны, нм Рис. 13. Пептидогликангидролазная активность рекомбинантного белка Rpf и его мутантных форм. 1 – Rpf - дикий тип; мутантные формы Rpf: 2 - E54Q, 3 - E54A, 4 - E54K, 5 - C53K+C114T, 6 - контроль-буфер. Приведены значения интенсивности флюоресценции (NAG)3-MUF при длине волны возбуждения 360 нм и эмиссии 450 нм после 3-х часового гидролиза при 370С в присутствии рекомбинантных белков Rpf.

Интенсивность флуоресценции, отн. ед.

Кроме того, ярко прослеживающаяся корреляция между биологической и ферментативной активностями белка Rpf позволяет говорить о том, что литическая активность в отношении пептидогликана – основного компонента бактериальной клеточной стенки, по-видимому, позволяет ему модифицировать утолщенную клеточную стенку НК клеток, разрыхляя ее и обеспечивая тем самым поступление питательных веществ внутрь клеток и инициируя процесс пробуждения. Несмотря на то, что наиболее вероятная «укладка» молекулы белка Rpf принадлежит к так называемому лизоцимоподобному типу (Cohen-Gonsaud et al., 2004), основная его функция заключается, по-видимому, не в разрушении пептидогликана, а, сходно с литическими трансгликозилазами, в локальном гидролизе для наращивания и встраивания новых молекул, составляющих пептидогликан (Cohen-Gonsaud et al., 2005).

Поскольку белок Rpf, несомненно, играет ведущую роль в процессе реактивации НК клеток, было высказано предположение относительно участия белков семейства Rpf и в процессе перехода клеток в НК состояние. Детекция уровня продукции белков Rpf бактериями M. smegmatis и M. tubercolosis проводилась иммунологическими методами. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) позволил определить, что суммарное содержание белков Rpf M.

tuberculosis в активной культуре, находящейся в стационарной фазе, не превышает 100 пг в расчете на 1 мг сухого веса клеток, а содержание их в супернатанте, взятом из культуры, лежит за пределами чувствительности метода. Для активно растущей культуры М. smegmatis суммарное содержание белков Rpf в супернатанте тоже очень низко и достигает максимума накопления в логарифмическое фазе роста – около 50 пг/мл, а в стационарной фазе также лежит за пределами детекции метода. Полученные результаты достаточно резко контрастируют с данными, касающимися бактерии М. luteus, уровень продукции белка Rpf для которой в супернатанте культуры, находящейся в поздней логарифмической стадии роста, достигал 1 мкг/мл. В связи с малыми количествами белков Rpf в клетках микобактерий, что, очевидно, указывает на их регуляторную роль, в дальнейших исследованиях применялся подход оценки уровня продукции белков семейства Rpf на уровне транскрипции.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»