WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Транскриптомный анализ. Из образцов тотальной РНК M. smegmatis, выделенных в трех независимых экспериментах для каждой временной точки, была получена флюоресцентно меченная комплиментарная ДНК реакцией обратной транскрипции со случайными праймерами и в присутствии меченного цианином-5 (Cy-5) дезоксицитидинтрифосфата. Необходимая для контроля геномная ДНК также была мечена флюоресцентным красителем другой длины волны испускания – цианином-3 (Cy-3) с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы, случайных праймеров и меченного Cy-дезоксицитидинтрифосфата. Смесь флюоресцентно меченных геномной ДНК и кДНК конкурентно гибридизовали в двух повторностях с продуктами генспецифичной ПЦР-амплификации полного генома M. smegmatis. Качественная и количественная оценка результата для каждого из продуктов гибридизации проводилась по длине волны испускания и ее интенсивности с помощью двулучевого сканирующего ридера Affymetrix («Biotech»), к рассмотрению принимались данные, дающие согласованный результат в двух повторностях.

Определение мурамидазной активности белков Rpf и его модификаций.

Использовали специфический субстрат 4-метилумбелиферил--d-N,N`,N``триацетилхитотриозид ((NAG)3-MUF) («Sigma», США). Субстрат (конечная концентрация 8 мкМ) инкубировали с белком (конечная концентрация 1-мкг/мл) в присутствии 5 мМ МgSO4 в 50 мМ натрий-цитратном буфере pH 6,0 в течение 3 часов при температуре 37oC. Интенсивность флуоресценции детектировали на флуориметре RF-5301PC («Shimadzu», Япония), длина волны возбуждения 360 нм и эмиссии 450 нм.

Электрофорез белков Rpf в ПААГ проводили по стандартной методике Лэммли (Laemmli, 1970) в присутствии ДДС-Na в электрофоретической камере («Bio-Rad» США) при 40С. Концентрация акриламида в разделяющем геле составляла 12%. Окраску белков проводили раствором коллоидного кумасси.

Иммуноблоттинг белков Rpf. Для постановки блоттинга использовали аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела против Rpf, специфичные к нативному белку Rpf, всем формам рекомбинантных белков Rpf (Mukamolova et al., 2002) в разведении 1:3000, а также мышиные моноклональные антитела, специфичные к Rpf C в разведении 1:5000, Rpf D в разведении 1:1000, Rpf Е в разведении 1:5000 и кроличьи поликлональные антитела, специфичные к вариабельному участку Rpf B в разведении 1:50000. В качестве вторичных антител использовали соответственно антикроличьи или антимышиные антитела IgG, коньюгированные щелочной фосфатазой («Sigma», США) в разведении 1:5000.

Блоттинг проводили на нитроцеллюлозной мембране Trans-Blot Transfer Medium («Bio-Rad», США), (размер пор 0,45 мкм) по стандартной методике.

В третьей главе представлены собственные результаты.

ПОЛУЧЕНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ» ФОРМ БАКТЕРИЙ РОДА MYCOBACTERIUM Оптимизация модели перехода клеток M. smegmatis в НК состояние при росте в стационарной фазе в аэробных условиях. Ранее было показано, что бактерия M. smegmatis при росте в стационарной фазе на не содержащей калия модифицированной среде Hartman’s-de Bont в аэробных условиях обладает способностью переходить в НК состояние (Shleeva et al., 2004). Однако данная модель отличалась большой зависимостью эффективности перехода в НК состояние от возраста инокулята (Рис. 1). Было обнаружено, что добавление к модифицированной среде Hartman’s-de-Bont бычьего сывороточного альбумина в количестве 0,5% позволило значительно расширить диапазон возраста инокулята, приводящего к формированию НК фенотипа. Кроме того, в присутствии БСА потеря клетками M. smegmatis способности культивироваться на твердых средах происходила уже после 72 ч роста, а не 96, как это было показано ранее (Рис.2).

0 20 40 60 80 время, часы Рис. 1. Влияние возраста инокулята на переход клеток M. smegmatis в «НК» состояние. Клетки, инокулированные на модифицированную среду Hartman’s-deBont, выращивались предварительно на среде Nutrient Broth с 0,05% твин-80 в течение различного времени (24, 30, 48ч). 1 – 24 ч, 2 – 30 ч, 3 – 48 ч.

Таким образом, была получена хорошо воспроизводимая модель получения НК форм M. smegmatis при росте в стационарной фазе в аэробных условиях. Функция БСА в данном случае, возможно, заключается в сорбции жирных кислот, накапливающихся в культуральной жидкости, и оказывающих, как предполагается, повреждающее действие на клетки, что может приводить к криптическому росту. В присутствии БСА устраняется проблема гетерогенности популяции и происходит некая «синхронизация» культуры, тем самым упрощается переход клеток в НК состояние.

КОЕ/мл 0 10 20 30 40 50 60 70 время, часы Рис. 2. Увеличение эффективности перехода клеток M. smegmatis в НК состояние в присутствии БСА. Клетки, инокулированные на модифицированную среду Hartman’s-deBont с добавлением 0,5% БСА, выращивались предварительно на среде Nutrient Broth с 0,05% твин-80 в течение различного времени (20, 32, 35, 48ч). – 20 ч, 2 – 32 ч, 3 – 35 ч, 4 – 48 ч.

Формирование покоящихся клеток культурой M. tuberculosis при инкубировании в стационарной фазе в аэробных условиях. Так как была показана возможность перехода в НК состояние для клеток M. smegmatis – быстрорастущего непатогенного родственника возбудителя туберкулеза M.

tuberculosis в аэробных условиях, была поставлена задача разработать модель перехода в НК состояние в аэробных условиях и для клеток M. tuberculosis.

Как и ожидалось, при выращивании M. tuberculosis на среде Sauton с добавлением глюкозы, БСА и хлорида натрия – т.е. в условиях, оптимальных для роста микобактерий, не наблюдалось снижения способности клеток образовывать колонии на твердой среде даже при длительной (более 3-х месяцев) инкубации в стационарной фазе. При росте M. tuberculosis на модифицированной среде Hartman’s-de Bont в присутствии 0.5% БСА – т.е. на среде, приводящей к резкому падению культивируемости M. smegmatis, заметного падения численности КОЕ также не происходило (Рис. 3).

После проверки нескольких вариантов сред и комбинации различных факторов было выяснено, что культивирование M. tuberculosis на модифицированной (не содержащей калия) среде Sauton с добавлением глюкозы, БСА и хлорида натрия позволило наблюдать снижение способности образовывать колонии на твердой среде при росте в стационарной фазе. Через 60 дней культивирования число КОЕ в мл среды снижалось до 105 (Рис. 3). Такие НК клетки могли быть реактивированы при культивировании на свежей среде роста. Однако при продолжении инкубации клеток в стационарной фазе наблюдался самопроизвольный возврат способности КОЕ/мл образовывать колонии на твердых средах, т.е. имело место так называемое «узкое окно некультивируемости» клеток протяженностью несколько суток.

Таким образом, была продемонстрирована возможность формирования НК фенотипа клетками M. tuberculosis в аэробных условиях.

0 20 40 60 80 время, сутки Рис. 3. Образование НК клеток M. tuberculosis в аэробных условиях при длительном культивировании их в стационарной фазе возможно на модифицированной среде Sauton. 1 – среда Sauton нормального состава c добавлением БСА, глюкозы и NaCl, 2 – модифицированная среда Hartman’s-deBont c добавлением БСА, 3 – модифицированная среда Sauton, не содержащая калия, c добавлением БСА, глюкозы и NaCl.

ХАРАКТЕРИСТИКА НК ФОРМ M. smegmatis: АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ПРИ ПЕРЕХОДЕ КЛЕТОК В СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ».

Дыхательная и ДФИ-редуктазная активность клеток. При измерении дыхательной активности клеток M. smegmatis было обнаружено, что уровень эндогенного дыхания НК клеток крайне низок и не превышает 1,5% от уровня дыхания метаболически активных клеток (Рис. 4). В присутствии глюкозы и малата происходила некоторая стимуляция дыхательной активности, хотя в случае НК клеток уровень стимулированного дыхания все равно оставался очень низким.

При измерении удельной величины эндогенных ДФИ-редуктаз клеток в расчете на 1 мг сухого веса биомассы в процессе образования НК форм наблюдалось падение активности одновременно со снижением культивируемости клеток. К моменту полной потери клетками способности культивироваться на твердых средах (72 ч) ДФИ-редуктазная активность снижалась до нуля (Рис. 5). Для КОЕ/мл метаболически активных клеток в стационарной фазе при измерении удельной величины метаболически активных клеток наблюдалось постепенное увеличение активности при росте в стационарной фазе.

Подобное снижение ДФИ-редуктазной и дыхательной активности для НК клеток означает, что функционирование дыхательной цепи заторможено, что может быть вызвано, например, ингибированием ферментов дыхательной цепи. В связи с этим было проведено измерение активностей ряда мембранных ферментов M. smegmatis на препаратах изолированных мембран.

б а + глюкоза 5 мМ + малат 5мM эндогенное дыхание + малат 5 мМ + глюкоза 5 мМ эндогенное дыхание Рис. 4. Уровень дыхательной активности клеток M. smegmatis. а – метаболически активные клетки, б – НК клетки.

20 30 40 50 60 70 80 время, ч Рис. 5. ДФИ-редуктазная активность клеток M. smegmatis. 1 – метаболически активная культура, 2 – культура, образующая НК клетки.

----нмольО ·мин ·мг нмольО ·мин ·мг x--ед*мин *мг клеток ДФИ-редуктазная активность Измерение активностей мембранных ферментов M. smegmatis. Можно заметить, что активность НАДН-дегидрогеназы клеточных мембран при переходе в НК состояние практически не отличалась активности метаболически активных клеток, культивирование которых в стационарной фазе происходило без образования НК форм, и даже при полной потере культивируемости активность данного фермента сохранялась (Рис. 6).

Активность малат-дегидрогеназы для клеток, культивирование которых происходит без образования НК форм, находилась приблизительно на одном и том же уровне в продолжение культивирования в стационарной фазе роста. При росте с образованием НК форм активность малат-дегидрогеназы даже возрастала при переходе в НК состояние (Рис. 7).

Также была измерена активность НАДН–оксидазы мембран для метаболически активных клеток и клеток, образующих НК формы. Можно видеть, что ферментативная активность для обеих культур в процессе культивирования изменялась незначительно (Рис. 8).

Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что низкая дыхательная активность и достаточно сильное падение ДФИ-редуктазной активности у НК клеток М. smegmatis вызвано не ингибированием ферментов дыхательной цепи, а, по-видимому, нехваткой внутриклеточных субстратов, что может являться результатом торможения основных метаболических путей и падением метаболической активности.

а б 108 107 102 101 0 35 40 45 50 55 60 65 70 50 60 70 80 время, ч время, ч Рис. 6. Ферментативная активность НАДН-дегидрогеназы клеточных мембран M. smegmatis. а – метаболически активные клетки: 1 – число КОЕ/мл, 2 – ферментативная активность; б – клетки, переходящие в НК состояние: 1 – число КОЕ/мл, 2 – ферментативная активность.

----КОЕ/мл КОЕ/мл ак-ть, ед * мин * мкг ак-ть, ед * мин * мкг а б 50 1010 109 40 108 107 30 106 105 20 104 103 10 102 101 0 100 40 50 60 70 80 90 100 35 40 45 50 55 60 65 70 время, ч время, ч Рис. 7. Ферментативная активность малат-дегидрогеназы клеточных мембран M. smegmatis. а – метаболически активные клетки: 1 – число КОЕ/мл, 2 – ферментативная активность; б – клетки, переходящие в НК состояние: 1 – число КОЕ/мл, 2 – ферментативная активность.

a б 2,2,1,1,1, 1,1,1, 1,1, 103 1,1,0,0,0,0,6 50 60 70 80 90 100 35 40 45 50 55 60 65 70 время, ч время, ч Рис. 8. Ферментативная активность НАДН-оксидазы клеточных мембран M.

smegmatis. а – метаболически активные клетки: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность; б – клетки, переходящие в НК состояние: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность.

Измерение активности внутриклеточных ферментов. Для проверки этого предположения была определена активность одного из ферментов цикла Кребса – изоцитратдегидрогеназы. Оказалось, что по мере снижения культивируемости наблюдается также падение ферментативной активности. Так, для НК клеток активность изоцитратдегидрогеназы составляет не более 30% от активности в точке, соответствующей началу стационарной фазы. Для метаболически активных ----КОЕ/мл КОЕ/мл ак-ть, ед * мин * мкг ак-ть, ед * мин * мкг ----КОЕ / мл КОЕ / мл ак-ть, мкмоль НАДН * мин * мкг белка ак-ть, мкмоль НАДН * мин * мкг белка клеток в стационарной фазе также отмечалось некоторое снижение изоцитратдегидрогеназной активности (Рис. 9).

Активность изоцитратлиазы – фермента глиоксилатного шунта, метаболического пути, альтернативного циклу Кребса, при переходе в стационарную фазу снижалась резко как для метаболически активных клеток, так и для клеток, рост которых происходит с образованием НК форм (Рис. 10).

а б 101 40 50 60 50 60 70 80 время, ч время, ч Рис. 9. Активность изоцитратдегидрогеназы в клетках M. smegmatis.

а – метаболически активные клетки: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность; б – клетки, переходящие в НК состояние: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность.

а 108 1 10 103 2 5 30 40 50 60 50 60 70 80 90 время, ч время, ч Рис. 10. Активность изоцитратлиазы в клетках M. smegmatis. а – метаболически активные клетки: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность; б – клетки, переходящие в НК состояние: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность.

----КОЕ/мл КОЕ/мл ак-ть, мкмоль НАДН * мин мг * белка ак-ть, мкмоль НАДН * мин мг * белка ----КОЕ / мл КОЕ / мл ак-ть, мкмоль НАДН * мин * мг белка ак-ть, мкмоль НАДН * мин * мг белка Таким образом, можно говорить о существенном снижении метаболической активности в случае НК форм M. smegmatis, что является следствием падения активности, по крайней мере, нескольких внутриклеточных ферментов.

Достаточно высокая ферментативная активность мембранных белков сохраняется в некультивируемом состоянии, по-видимому, из-за того, что они иммобилизованы в мембранах.

Транскриптомный анализ. C целью выяснить, существуют ли в клетках M.

smegmatis какие либо белки (или ферменты), активность которых при переходе в состояние «некультивируемости» возрастала бы вследствие увеличения уровня экспрессии их генов, был проведен глобальный транскриптомный анализ культуры M. smegmatis при переходе в НК состояние. Если такие белки удастся выявить, то тогда переход клеток в НК состояние логично было бы рассматривать как активный, генетически регулируемый процесс, отражающий определенную стратегию выживания в неблагоприятных условиях.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»