WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

САЛИНА Елена Геннадьевна «НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫЕ» ФОРМЫ БАКТЕРИЙ MYCOBACTERIUM SMEGMATIS И MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS И ИХ БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Капрельянц Арсений Сумбатович Официальные оппоненты доктор биологических наук Королева Ольга Владимировна доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна Ведущая организация Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Защита состоится «05» декабря 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « 2 » ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Существует предположение, что латентная форма туберкулезной инфекции связана с переходом клеток возбудителя – неспорулирующей бактерии Mycobacterium tuberculosis – в покоящееся состояние в организме человека, причем такие покоящиеся клетки сохраняют жизнеспособность и могут реактивировать, а значит, представляют угрозу активного развития заболевания.

Традиционно покоящееся состояние бактерий связывали с формированием специализированных структур, таких как споры и цисты, однако к настоящему моменту становится очевидным, что многие неспорулирующие бактерии, в том числе патогенные, в определенных условиях способны переходить в состояние покоя без образования специализированных структур.

В связи с этим предпринимались многочисленные попытки моделирования латентного состояния туберкулеза in vitro. Инкубация микобактерий в условиях постепенного снижающейся концентрации кислорода позволяла наблюдать переход клеток M. tuberculosis в «нерепликативное состояние» (Wayne, 1994), однако такое покоящееся состояние не сопровождалось снижением культивируемости, что не свойственно клеткам возбудителя, находящимся в организме в латентном состоянии. Недавно в нашей лаборатории была разработана модель получения покоящихся клеток M. tuberculosis, сопровождающаяся формированием «некультивируемого» (НК) фенотипа, но такие клетки могли быть получены только в анаэробных условиях (Shleeva et al., 2002). Возможно, данное покоящееся состояние является лишь отражением адаптации клеток микобактерий, являющихся аэробами, к недостатку кислорода.

Кроме того, сложно сказать, насколько анаэробные условия отвечают реальным условиям, в которых туберкулезные бактерии находятся в тканях организмахозяина. Так, из литературных данных известно, что в тканях инфицированных мышей бактерии не испытывают недостатка кислорода (Tsai et al., 2006).

Поэтому разработка модели перехода бактерий M. tuberculosis в НК состояние в аэробных условиях представляет большую важность. Ранее сотрудниками нашей лаборатории была показана возможность перехода бактерии Mycobacterium smegmatis, быстрорастущего непатогенного родственника M. tuberculosis, в покоящееся состояние при культивировании в длительной стационарной фазе в аэробных условиях (Shleeva et al., 2004). При этом такие покоящиеся клетки теряли способность расти на твердых питательных средах, то есть являлись «некультивируемыми». Мы предполагаем, что НК клетки M. smegmatis могут рассматриваться как модель латентной туберкулезной инфекции in vivo.

Однако к моменту начала данной работы было известно только о существовании феномена «некультивируемости» M. smegmatis, сами же клетки в НК состоянии не были охарактеризованы, неясным было, какие факторы оказывают влияние на процесс перехода бактерий в состояние «некультивируемости» (покоя), и является ли этот процесс генетически программированным, активным, или он связан с деградацией клеток и их последующей гибелью. Кроме того, необходимо было выявить механизмы, лежащие в основе процесса реактивации покоящихся клеток микобактерий.

Цель и задачи исследования Цель данной работы заключалась в биохимической характеристике НК форм микобактерий, а также изучении механизмов перехода бактерий в НК состояние и выявлении факторов, обеспечивающих их последующую реактивацию. В соответствии с целью работы были поставлены задачи:

1.Оптимизация метода получения in vitro «некультивируемых» форм бактерии Mycobacterium smegmatis - быстрорастущего непатогенного родственника Mycobacterium tuberculosis.

2.Разработка метода получения in vitro покоящихся («некультивируемых») форм бактерии M. tuberculosis в аэробных условиях.

3.Биохимическая характеристика клеток M. smegmatis в «некультивируемом» состоянии.

4.Исследование изменения уровня экспрессии генов (транскриптомный анализ) при переходе M. smegmatis в «некультивируемое» состояние.

5.Изучение механизмов функционирования белков семейства Rpf в процессе реактивации «некультивируемых» форм микобактерий.

Научная новизна 1. Найдены условия для получения «некультивируемых» клеток M. tuberculosis при росте в длительной стационарной фазе в аэробных условиях.

2. Впервые проведена биохимическая характеристика «некультивируемых» форм M. smegmatis, показано, что «некультивируемое» состояние характеризуется повышенным уровнем экспрессии ряда генов, продукты которых принимают участие в анаболических процессах, что позволяет рассматривать переход клеток в данное состояние как активный, генетически программируемый процесс.

3. Впервые показано, что реактивирующее действие белков семейства Rpf в отношении «некультивируемых» клеток микобактерий связано с их пептидогликангидролазной активностью.

Научно-практическое значение Разработанные модели получения НК клеток микобактерий и проведенная биохимическая характеристика НК состояния M. smegmatis in vitro являются важными для дальнейшего понимания явления туберкулезной латентности и механизмов, посредством которых оно регулируется, а для также выявления факторов, влияющих на переход бактерий в состояние «некультивируемости».

Проведенные исследования могут быть использованы для выявления у патогенных бактерий генов, участвующих в процессах персистенции в организме человека, продукты экспрессии которых могут явиться мишенями для создания новых лекарственных препаратов и, в частности, противотуберкулезных средств.

Апробация работы Материалы диссертационной работы докладывались на научных конференциях: 8-ой школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), 2-ой региональной конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004), 15th European Соngress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Copenhagen, Denmark, 2005), 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006).

Публикации По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, среди которых 4 статьи в российских и международных научных журналах.

Структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы включает наименований.

Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы.

Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный покоящемуся («некультивируемому») состоянию неспорулирующих бактерий. Отдельное внимание уделено рассмотрению НК состояния микобактерий в связи с острой проблемой латентного туберкулеза в современном мире. Кратко описаны экспериментальные подходы к изучению НК форм микобактерий. Изложены современные представления о биохимических особенностях и генетической регуляции перехода в состояние «некультивируемости».

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Выращивание бактериальных культур.

Mycobacterium smegmatis. Штамм дикого типа mc2 155 и мутантные штаммы выращивались первоначально при 37°C и 240 об/мин на среде Nutrient Broth (“Himedia”, Индия) с добавлением 0,05% твин-80. Затем культуру пересевали на модифицированную среду Hartman’s-de Bont (H-dB) и выращивали при 37°C и об/мин. Для получения НК клеток к модифицированной среде H-dB добавляли БСА (“Sigma”, США) в количестве 0,5%.

Mycobacterium tuberculosis. Штамм Н37Rv и мутантные штаммы первоначально выращивали на среде Sauton в присутствии 0,05% твина-80 с добавлением БСА, глюкозы и NaCl при 37°C и 200 об/мин. Затем для получения НК клеток в аэробных условиях культуру пересевали на модифицированную среду Sauton, не содержащую калия, с добавлением 0,05% твин-80, БСА, глюкозы и NaCl и выращивали при 37°C и 200 об/мин. Для получения НК клеток в условиях недостатка кислорода использовали герметично закрытые колбы со средой Sauton нормального состава и добавлением 0,05% твина-80, БСА, глюкозы и NaCl.

Оценка культивируемости клеток проводилась по их способности образовывать колонии на твердых питательных средах. Разведения суспензии бактериальных клеток высевали на агаризованную (1,5% агара) питательную среду (среда Sauton с добавлением БСА, глюкозы и NaCl для M. tuberculosis; среда Nutrient Broth для M. smegmatis). Инокулированные чашки культивировали при 37оС. Число колониеобразующих единиц (КОЕ) подсчитывали через 5 суток (M.

smegmatis), 3-4 недели (M. tuberculosis) после высева. Предел обнаружения КОЕ составлял 5 клеток в мл среды.

Pеактивация НК клеток M. smegmatis. Для оценки числа реактивировавшихся клеток использовали метод конечных разведений (МКР), заключающийся в приготовлении серии последовательных 10-кратных разведений. Значение наиболее вероятного числа (НВЧ) реактивированных клеток определяли по стандартным статистическим таблицам (de Man, 1975).

M. smegmatis. Процедуру реактивации проводили в течение 6 суток при 37 0С и 120 об/мин в среде Sauton нормального состава с добавлением 0,05% дрожжевого экстракта. Контрольные лунки содержали дополнительно продуцент белка Rpf – бактерию Micrococcus luteus в концентрации 105 кл/мл.

M. tuberculosis. Процедуру реактивации проводили течение 2-х месяцев при 370С в статическом режиме на среде Sauton нормального состава с добавлением БСА, глюкозы и NaCl.

Приготовление клеточных экстрактов и выделение мембран клеток.

Биомассу клеток M. smegmatis разрушали на дезинтеграторе BeadBeater («BioSpecProducts», США) с циркониевыми бусами, неразрушенные клетки отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 3 мин. Супернатант вновь центрифугировали (14000 об/мин, 20 мин), полученный осадок клеточных мембран промывали трижды 50 мМ фосфатным буфером рН 7,0 в присутствии мМ Mg2+, ресуспендировали в 0,2 М растворе сахарозы и хранили при –20 0С, а супернатант подвергали ультрацентрифугированию в течение 1 часа при 215000 g и 3 0С, полученный экстракт клеток хранился при –70 0С.

Определение активностей внутриклеточных ферментов.

Активность изоцитратлиазы определяли флюориметрически по изменению уровня флюоресценции НАДН при окислении его в НАД+, при длине волны возбуждения 340 нм и испускания 455 нм. Глиоксилат, образующийся из изоцитрата под действием изоцитратлиазы, восстанавливался в гликолат при участии лактатдегидрогеназы и сопутствующем окислении НАДН.

Активность изоцитратдегидрогеназы определяли флюориметрически при длине волны возбуждения 340 нм и испускания 455 нм по изменению уровня флюоресценции НАДР+ при восстановлении его в НАДРН, сопровождающем превращение изоцитрата в альфа-кетоглутарат.

Определение оксидазных и дегидрогеназных активностей Дыхательную активность клеток измеряли по скорости поглощения кислорода в термостатируемой полярографической ячейке.

Активность НАДН- и малатдегидрогеназ определяли спектрофотометрически по изменению оптической плотности искусственного акцептора электронов 2,6дихлорфенол-индофенола в присутствии менадиона и 5 мкмоль субстрата при нм.

Активность эндогенных ДФИ-редуктаз в клетках измеряли в таких же условиях, исключая добавки субстрата.

Активность НАДН-оксидазы определяли флюориметрически по убыли интенсивности флюоресценции НАДН при окислении его в НАД+ при длине волны возбуждения 340 нм и испускания 455 нм.

Выделение и очистка РНК. Клетки M. smegmatis., осажденные центрифугированием, (10 мин, 5000 об/мин, 25 0C), инкубировали в течение 1 часа в лизирующем растворе гуанидинизоцианата. Полученный осадок лизированных клеток ресуспендировали в тризоле («Invitrogen», Великобритания) и разрушали в присутствии циркониевых бус на дезинтеграторе BeadBeater («BioSpec Products», США). Далее РНК экстрагировали хлороформом, осаждали изопропанолом, отмывали 70% этанолом и растворяли в воде, не содержащей нуклеиновых кислот, с добавлением ингибитора РНКаз («Promega», США). Образцы выделенной РНК дважды обрабатывали ДНКазой («Promega», США) и очищали, используя набор для выделения РНК SV Total RNA Isolation Kit («Promega», США). Концентрацию РНК оценивали спектрофотометрически. Контроль отсутствия ДНК в полученных образцах РНК проводили с помощью ПЦР со специфическими праймерами.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»