WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

За основу технологического процесса производства препарата иммуноглобулина для внутривенного введения с цельными молекулами IgG в мономерной форме и полностью сохраненными как эффекторной, антигенсвязывающей активностью, так и функциями Fc-фрагмента, был взят лабораторный метод /Алешкин В.А., Лютов А.Г., 1998, Лютов А.Г., Алешкин В.А., 1996/. Предлагаемая схема получения препарата предусматривала концентрирование фильтрата «Б» (III фракция по Кону) ультрафильтрацией при значении рН от 3,5 до 5,0 с последующим длительным диализом полуфабриката иммуноглобулина в вискозных оболочках для снижения антикомплементарной активности.

Задачей первого раздела исследований было совмещение данных методических приемов со схемой фракционирования плазмы, принятой на Ивановской областной станции переливания крови.

Проведенный анализ технологического процесса фракционирования плазмы, принятого на станции, и эксперимент, выполненный в лабораторных условиях по концентрированию фильтрата "Б" на ультрафильтрационном модуле, показали принципиальную возможность приготовления препарата иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения. Экспериментальный образец содержал более 95 % мономерного IgG и имел антикомплементарную активность 10 мг белка, не активирующих 2 СН50 (рис. 1).

Уровень активации комплемента КК 2,5 5 10 Количество белка в пробе, мг ИГ для внутримышечного введения ИГ для внутривенного введения Рис. 1. Антикомплементарная активность экспериментального образца иммуноглобулина КК – контроль комплемента Примечание: Иг не должен активировать 2 гемолитические единицы комплемента (2СН 50) Положительные результаты эксперимента позволили перейти к масштабированию технологии. Процесс концентрирования фильтрата «Б» в производственных условиях проводили на 5 ультрафильтрационных кассетах фирмы «Владисарт», использовали промышленный шестеренчатый насос с регулируемой производительностью.

Центрифугат "Б" в количестве 177 л был разведен водой очищенной в соотношении 1:1, а величина рН раствора была снижена до 4,3. После концентрирования и диафильтрации (для полного освобождения иммуноглобулина от остаточного содержания этанола и солей) раствор иммуноглобулина подвергли осветляющей и стерилизующей фильтрации. Снижение антикомплементарной активности было проведено диализом в вискозных оболочках, а затем препарат Гемолиз, % был высушен. Иммуноглобулину было присвоено торговое наименование "Габриглобин".

Аналогичным образом были приготовлены еще четыре серии препарата.

Анализ биологических и иммунохимических параметров полученных образцов показал, что все параметры производственных серий иммуноглобулина соответствовали требованиям фармакопейной статьи. Однако антикомплементарная активность трех серий из пяти составила только 5 мг белка, не активирующих комплемент, хотя значительных отличий в технологических приемах, которые были использованы во время процесса приготовления препарата, найдено не было.

Подробный анализ всех стадий технологического процесса показал, что процесс высушивания, как наиболее критичный, не оказывает существенного влияния на иммуноглобулин. Было высказано предположение о том, что параметры конечной продукции может определять качество дистиллированной воды, используемой в технологическом цикле приготовления препарата. В пользу этого предположения свидетельствовал тот факт, что экспериментальный образец иммуноглобулина, приготовленный с использованием дистиллированной воды трехкратной перегонки, полученной на Ивановской ОСПК, имел антикомплементарную активность только 5 мг белка, тогда как образец иммуноглобулина, изготовленный из той же партии фильтрата "Б", но на дистиллированной воде однократной перегонки в МНИИЭМ им.

Г.Н.Габричевского, имел антикомплементарную активность 10 мг белка, не активирующих 2 СН50.

Сравнительный полуколичественный анализ качества воды показал, что в воде из Иваново более высокое значение величины рН, чем в воде из МНИИЭМ Г.Н.Габричевского, одинаковое содержание восстанавливающих веществ, и несколько более высокое количество нитритов, нитратов и тяжелых металлов.

Исследования Tenold R.A. /1983/ продемонстрировали, что чем меньше раствор иммуноглобулина содержит низкомолекулярных примесей в виде NaCl, спирта и пр., то тем больший процент молекул IgG находится в мономерной форме и тем ниже его антикомплементарная активность. По-видимому, определяющее влияние дистиллированной воды на качество "Габриглобина", объясняется наличием в воде Ивановской ОСПК повышенного содержания ионов тяжелых металлов, которые могут дестабилизировать гидратную оболочку молекул иммуноглобулина, снижать его дзета-потенциал, что приводит к изменению конформации молекулы, образованию агрегатов и раскрытию участков, связывающих компоненты комплемента.

Опираясь на полученные данные, в технологическом цикле приготовления препарата мы предложили использовать в дальнейшем только воду, приготовленную путем обратного осмоса, что обеспечило стабильность всех показателей препарата от серии к серии.

Далее, для увеличения объема выпускаемой продукции, был проведен комплекс исследований по замене ручной стадии диализа иммуноглобулина в вискозных оболочках (этап уменьшения антикомплементарной активности) на диафильтрацию полуфабриката с использованием ультрафильтрационной кассетной системы.

Для подбора условий снижения антикомплементарной активности иммуноглобулина методом диафильтрации полуфабриката на ультрафильтрационном модуле было исследовано несколько режимов проведения процесса и выбран метод, обеспечивающий гарантированное снижение антикомплементарной активности иммуноглобулина, заключающийся в использовании противотока диализирующей жидкости.

В результате первого этапа исследований, посвященного масштабированию процесса и поддержанию стабильных показателей качества препарата от серии к серии, с 2002 г. организован промышленный выпуск препарата "Иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения сухой", получившего коммерческое название "Габриглобин" (ФСП № 42-0265-1621-01).

Разработка методов инактивации возможно присутствующих вирусов.

Препараты крови человека, получаемые путем фракционирования, не могут быть в полной мере вирусобезопасными, поскольку не представляется возможным получение крови от абсолютно здоровых доноров. Даже карантинизация всех порций плазмы не может дать 100 %-ную гарантию отсутствия инфекционных агентов. Панов В.П. и соавт. /2005/ указывают, что вирусная безопасность продуктов крови обеспечивается тремя непременными факторами: отбором доноров, тестированием донаций и пулов плазмы, инактивацией и удалением вирусов в процессе производства, причем способы удаления вирусов должны быть четко различимы от способов их инактивации.

Несмотря на то, что, по данным Henin et al. /1988/, в фильтрате "Б" вирус иммунодефицита не определяется, теоретическая возможность передачи на сегодняшний день неизвестных инфекций остается. Вследствие этого одной из задач исследования было изучение возможности включения в технологический цикл производства габриглобина двух стадий вирусинактивации.

Известны различные подходы по инактивации и удалению вирусов, включающие: пастеризацию, химическую инактивацию, сухой нагрев и др.

/Русанов В.М., Левин И., 2004; Kasper C.K., Silva M.C., 2003/. Доказано, что при низкой величине рН разрушаются липид-содержащие (вирус СПИДа, гепатита В, гепатита С) и липид-несодержащие (вирус гепатита А, парвовирус В 19) вирусы /Louie R.E.et al., 1994/. Эффективность инактивации вирусов во время обработки полуфабриката иммуноглобулина при показателе рН от 4,0 до 4,5 валидирована (подтверждена) ведущими странами (ФРГ, США, Канада) /Мостовская Е.В., 2004;

Исрафилов А.Г. и соавт., 2005; Revie D., 1998/.

Данные литературы убедительно свидетельствуют об эффективности процессов вирусной инактивации при кислом значении рН или высокой температуре, что позволило нам не проводить работу по контролю инактивации модельных вирусов, а сосредоточить внимание на исследовании влияния различных вариантов вирусинактивации на основные показатели качества габриглобина.

Первой стадией инактивации возможно присутствующих вирусов в технологическом цикле приготовления препарата "Габриглобин" стал этап выдерживания полуфабриката при величине рН 4,2 в течение 21 суток. Оценка качества полуфабриката до и после выдерживания при данных условиях показала, что различия основных параметров иммуноглобулина были статистически незначимыми (значение р от 0,226 до 1,0), что доказывает отсутствие влияния условий инкубации препарата на его качественные характеристики.

Учитывая данные о высокой эффективности инактивации вирусов методом сухого прогрева или пастеризации /Зубкова Н.В., Анастасиев В.В., 2002; Horowitz B. et al., 1992; Laso M. et al., 2002/, в качестве второй стадии вирусинактивации возможно присутствующих вирусов был использован прогрев сублимационно высушенного габриглобина во флаконах. Для выбора режима вирусинактивации было проведено исследование влияния температурной обработки при 60, 70 и о С в течение 6, 24, 48 и 72 часов на отдельные параметры иммуноглобулина.

Анализ препаратов по ряду показателей, проведенный до и после прогревания, показал, что прозрачность и цветность испытуемых образцов несколько изменялись и зависели от длительности и режима прогрева. Тем не менее данные показатели находились в пределах допустимых значений в соответствии с требованием фармакопейной статьи.

Антикомплементарная активность габриглобина при различных режимах прогревания изменялась в зависимости от температуры и длительности инкубации (рис.2). При сопоставлении динамики изменения антикомплементарной активности препарата и его прозрачности в процессе инактивации было отмечено, что снижение антикомплементарной активности габриглобина с 20 до 10 мг белка сопровождалось уменьшением прозрачности раствора к 24 часам инкубации, а затем, к 72 часам, показатели прозрачности и антикомплементарной активности возвращались к исходным значениям. Механизм изменения данных показателей требует специального изучения.

30 0,0,0,20 0,0,0,10 0,0,0,0 0 6 24 48 Время инкубации, ч АКА (60 С) АКА (70 С) АКА (80 С) Пр. (60 С) Пр. (70 С) Пр. (80 С) Рис. 2. Изменение прозрачности (ПР) и антикомплементарной активности (АКА) габриглобина в процессе прогревания при различных режимах 540 нм активность, мг белка Оптическая плотность, Антикомплементарная Молекулярные параметры иммуноглобулина практически не изменялись при о прогревании сухих образцов при температуре 60 С, так и при выдерживании их при 80 оС.

Содержание антител к вирусу кори при всех режимах вирусинактивации оставалось стабильным на протяжении первых 24 часов и к 48 часам содержание антител уменьшалось на одно разведение. Концентрация антител к альфастафилолизину в образцах уменьшалась более плавно и зависела от температуры и длительности инкубации. Количество антител к ЦМВ в образцах иммуноглобулина о при прогревании при температуре 60 С снижалось к концу процедуры не более, о чем на 3,5 % (рис. 3). Однако прогревание препарата при 80 С привело к значительному падению уровня антител к ЦМВ уже через 24 часа (на 43 %), а к часам – на 53,9 %.

55 50 50 35,35,6,6,5,35 6,35,1 34,8 34,5,30 25 5 0 6 24 48 Время инкубации, ч АТ к вирусу кори АТ к ЦМВ Анти-альфа-стафилолизин Рис. 3. Изменение титров антител в препарате габриглобин во время выстаивания при температуре 60 оС Таким образом, был сделан вывод об отсутствии значительного влияния о прогревания сухой формы препарата габриглобина при 60 С в течение 72 часов или при 70 оС в течение 48 часов на качественные характеристики препарата.

ЦМВ, МЕ/мл Титр антител к альфастафилолизину, МЕ/мл Титр антител к вирусу кори и Производственные возможности и наличие оборудования на станции переливания крови позволили ввести в производственный процесс приготовления о вирусбезопасного габриглобина стадию прогревания препарата при 60 С в течение 72 часов.

Получение препарата внутривенного иммуноглобулина для лечения цитомегаловирусной инфекции.

В последнее время для комплексной терапии оппортунистических инфекций активно применяют препараты иммуноглобулинов человека /Кострова О.М., Алешкин В.А., 1995/. Предложен внутримышечный иммуноглобулин с повышенным титром антител к ЦМВ "Меговир" (Россия), импортные препараты для внутримышечного и внутривенного введения - цитотект (фирма “Biotest”, Германия), CMV-polyglobulin, (США), cytogam ("Medimmune", Великобритания) /Хабибулина В.В., 2003; Stippel D. et al., 1992; Kocher A.A. et al., 2003; Vrtovec B. et al., 2004/. Поэтому одной из задач настоящего исследования было изучение возможности получения иммуноглобулина для внутривенного введения с цельной, нерасщепленной молекулой IgG и высоким титром антител к ЦМВ.

С этой целью был определен титр антител к ЦМВ в препаратах нормального иммуноглобулина человека, выпускаемого Ивановской станцией переливания крови, и установлены критерии отбора донорской крови. Фоновое содержание указанных антител в иммуноглобулине составило величину 1:1600 - 1:3200 (титр в пересчете на 5 %-ный белок), поэтому, принимая во внимание минимальное различие в содержании антител между «нормальным» и «специфическим» иммуноглобулином в 4-6 раз, допустимый титр антител к ЦМВ в гипериммунном препарате должен составлять 1:6400 – 1:12800, а минимальный допустимый титр анти-ЦМВ-антител в плазме крови доноров иметь величину 1:1600.

Был создан банк из 107 доноров, имеющих титр антител к вирусу ЦМВ более 1:1600. Плазма, собранная методом плазмафереза, после карантинизации была использована для приготовления трех промышленных серий иммуноглобулина с повышенным титром антител к вирусу цитомегалии, получившего коммерческое название "Габриглобин-анти-ЦМВ".

Степень концентрирования антител к ЦМВ во всех полученных образцах составила 8 раз, что свидетельствует о правильности выбранных технологических параметров процедуры фракционирования. Титр антител в трех сериях препарата непосредственно после их изготовления составлял 1:12800 - 1:25600, что соответствовало расчетным данным на специфический антицитомегаловирусный иммуноглобулин. Через три года хранения (срок наблюдения) титр антител к ЦМВ уменьшался всего лишь на одно разведение, что, тем не менее, удовлетворяло заложенным в проект ФСП требованиям на препарат (1:6400). Другие параметры внутривенного иммуноглобулина также соответствовали требованиям нормативной документации в течение трех лет.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»