WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

На основании данных о содержании предшественников биосинтеза тетрапирролов в опытных и контрольных растениях, и данных, полученных с помощью ОТ-ПЦР, можно сказать, что содержание тетрапирролов в клетках коррелирует с содержанием транскриптов гена Elip. Эксперименты по изучению влияния повышенного содержания Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me на экспрессию генов Elip показали, что накопление в хлоропластах Mgпрото IX и его монометилового эфира приводит к частичному ингибированию транскрипции гена низкомолекулярного пластидного белка светового стресса Elip. Оба метода оценки содержания транскриптов гена Elip (нозерн-гибридизация и ОТ-ПЦР) дали сходные результаты.

3.2. Влияние синтеза белка в пластидах на экспрессию гена Elip. Для того чтобы выяснить возможную роль хлоропластных белков как пластидного сигнала, регулирующего экспрессию гена Elip, нами был использован линкомицин, ингибирующий синтез белков в пластидах. Проростки ячменя в течение 5 сут росли в темноте на 0,5 мМ растворе линкомицина, а затем были выставлены на свет (300 мкмоль квантов м–2сек–1) на 48 ч. С помощью нозерн-гибридизации мы сравнили уровень транскриптов гена Elip в опытных и контрольных растениях. Экспрессия ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip в опытных проростках не отличалась от его экспрессии в растениях, не подвергавшихся обработке ингибитором. Таким образом, подавление синтеза пластидных белков в 7-сут отн. содержание,% растениях не оказывает влияния на экспрессию гена Elip. У таких растений процесс трансляции в пластидах не участвует в регуляции экспрессии гена Elip. Ранее было показано, что на начальных этапах прорастания обработка линкомицином приводит к снижению экспрессии ядерных генов, кодирующих белки фотосинтеза хлоропластов. В проростках табака в результате действия ингибитора не накапливаются транскрипты генов Lhcb1 и RbcS в первые 2-3 дня развития проростков. На этом основании был сделан вывод о необходимости трансляции в хлоропластах в этот период развития проростков (Sullivan, Gray, 1999; Gray et al., 2003). Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансляция в пластидах 7-сут проростков ячменя не влияет на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид. По-видимому, синтез пластидных белков нужен для формирования сигнальной системы хлоропластов на более ранних этапах развития проростков.

3.3. Регуляция экспрессии гена Elip редокс-состоянием фотосинтетической электрон-транспортной цепи. Для того чтобы выяснить может ли редокс-состояние электрон-транспортной цепи хлоропластов выступать в роли пластидного сигнала при экспрессии гена Elip, мы использовали 3-(3’, 4’- дихлорфенил)- 1,1’ –диметилмочевину (DCMU) – специфический ингибитор, блокирующий транспорт электронов от ФСII к пулу пластохинонов (PQ), что предотвращает восстановление последнего и приводит к накоплению пула окисленного PQ. Опытные растения ячменя выращивали в течение 7 сут в темноте в водной культуре. После этого проростки переносили в среду, содержащую мкМ DCMU, таким же раствором опрыскивали растения и в течение 24 ч освещали белым светом (300 мкмоль квантов м–2 с–1). Световой режим контрольных и опытных растений был идентичен. Как следует из таблицы 2, фотохимическая активность ФСII у обработанных DCMU растений ингибирована на 30% по сравнению с контролем.

Таблица 2. Фотохимическая эффективность ФСII в проростках ячменя после обработки DCMU Варианты F0 Fm Fv = Fm – F0 Fv / Fm Fv / Fm отн. ед.

% Контроль 46 256,0 ± 0,030 210 0,820 ± 0,012 DCMU 46 107,5 ± 0,021 61,5 0,572 ± 0,02 Снижение фотохимической активности ФСII приводит к окислению пула пластохинонов. С помощью ОТ-ПЦР определяли уровень транскриптов у контрольных и обработанных DCMU проростков ячменя. В ходе исследований было показано, что содержание транскриптов Elip понижено у растений, обработанных ингибитором, и составляет всего 20-30% от контроля (рис. 9). Подавление переноса электронов от ФСII к пулу пластохинонов на 30% приводит к снижению уровня транскрипции гена Elip на 80%.

М DCMU – + п.н. Т К DCMU а б Рис. 9. Электрофореграмма ПЦР-продукта (567 п.н.) гена Elip, полученного с помощью ОТ - ПЦР.

а – электрофореграмма ПЦР-продукта в 1,5%-ной агарозе; б – относительное содержание (% от контроля) транскриптов Elip у проростков, обработанных DCMU; М – ДНК-маркеры («100 bp Ladder»). К – контроль.

Таким образом, обработка DCMU, вызывающая окисление пула пластохинонов, приводит к существенному ингибированию транскрипции гена Elip.

Заключение В настоящее время с помощью ингибиторного анализа и исследования мутантов обнаружены пять возможных путей передачи сигналов от хлоропластов к ядру (пять классов пластидных сигналов). Один из этих путей зависит от продукта (-ов) пластидного синтеза белков; второй – связан с синглетными формами кислорода; в третьем пути участвует перекись водорода, генерируемая хлоропластами; четвертый сигнальный путь контролируется редокс-состоянием электрон-транспортной цепи фотосинтеза и в пятом участвуют интермедиаты биосинтеза тетрапирролов (Beck, 2005). Эти пластидные сигналы являются частью сложной сигнальной сети, связывающей функциональное и физиологическое состояние хлоропластов с ядром.

В нашей работе мы попытались оценить участие трех классов пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов стрессовых хлоропластных белков (Elip и Hsp32).

% относительное содержание, Было исследовано участие промежуточных продуктов биосинтеза тетрапирролов, продуктов синтеза пластидных белков и редокс-состояния хлоропластов в регуляции экспрессии этих генов у ячменя.

На первом этапе исследований была изучена экспрессия генов Elip и Hsp32 в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласты. Маркерными генами служили ядерные гены белков фотосинтеза (Lhcb, RbcS), для которых доказана регуляция экспрессии с помощью пластидного сигнала. Показано, что в условиях фотодеструкции хлоропластов, вызванной норфлуразоном, ингибитором фитоиндесатуразы, в пластидах отсутствуют фотосинтетическая активность, тилакоидные мембраны и рибосомы. Однако ДНК и оболочка органелл повреждаются сравнительно мало. При сравнении экспрессии четырех ядерных генов - генов стрессовых белков пластид Elip и Hsp32 и генов белков фотосинтеза Lhcb и RbcS, в проростках ячменя, содержащих фотоповрежденные хлоропласты, было обнаружено, что транскрипция генов белков фотосинтеза наиболее чувствительна к пластидному сигналу. На экспрессию ядерного гена хлоропластного белка теплового шока Hsp32 пластидный сигнал не оказывает действия: его транскрипция практически не отличается у норфлуразон-обработанных и контрольных растений.

Поэтому можно говорить о том, что Hsp32 является геном, экспрессия которого относительно нечувствительна к пластидному сигналу. Уровень транскрипции гена Elip снижен у фотоповрежденных растений. Это указывает на то, что хлоропласты контролируют экспрессию данного гена. Наши результаты о регуляции экспрессии гена Elip согласуются также с представлением о том, что экспрессия ядерных генов регулируется функциональным состоянием пластид скорее непрерывно, чем дискретно по принципу «open-shut gate» (McCormac, Terry, 2004). Возможно, что различная чувствительность транскрипции изученных четырех генов к фотодеструкции хлоропластов отражает различия в регуляторных элементах промоторов соответствующих генов. Таким образом, хлоропласты принимают непосредственное участие в регуляции экспрессии ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip.

Обнаружено, что при фотодеструкции в хлоропластах ячменя кроме зрелых форм белков Elip и Hsp32 наблюдается накопление их предшественников. В этих условиях не обнаруживаются предшественники хлоропластных белков периферической антенны ФСII (Lhcb1) и малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы (RbcS). Как показали результаты нашей работы, это может объясняться тем, что транскрипция генов стрессовых белков продолжается, а транскрипция генов белков фотосинтеза заблокирована. При окислительном стрессе, вызванном недостатком каротиноидов, частично нарушается импорт белков в хлоропласты, при этом предшественники белков накапливаются в оболочке пластид. Такой вывод следует из опытов по обработке изолированных пластид экзогенными протеазами (трипсином). По-видимому, N-конец стрессового белка находится в оболочке пластид, в то время как С-конец экспонирован снаружи и поэтому подвержен действию протеаз. У NF-обработанных и контрольных растений предшественники стрессовых белков связываются с сайтами транслокации оболочки хлоропластов, но у NFобработанных растений реакция переноса частично нарушена.

Чтобы обнаружить корреляцию между уровнем экспрессии гена белка светового стресса Elip и содержанием тетрапирролов – предполагаемых сигнальных молекул, биосинтез которых локализован у высших растений в хлоропластах, использовали 2,2’дипиридил. Обнаружено, что повышение содержания Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me коррелирует с понижением экспрессии гена Elip. Это указывает на зависимость экспрессии гена хлоропластного белка светового стресса от внутриклеточного содержания интермедиатов биосинтеза тетрапирролов. В нашей работе впервые показано, что в регуляции транскрипции гена Elip у ячменя участвуют тетрапирролы, частично ингибируя экспрессию этого гена (на ~ 50%). Отсюда следует, что пластидный сигнал, медиаторами которого являются Mg-протопорфирин IX и Mg-протопорфирин IX-Me, подавляет транскрипцию данного гена, что позволяет говорить о негативной регуляции тетрапирролами экспрессии Elip. Сходные результаты получены при оценке содержания транскриптов гена Elip методом нозерн-гибридизации и OT-ПЦР.

Для выявления корреляции между уровнем экспрессии гена белка светового стресса и редокс-состоянием хлоропластов использовали специфический ингибитор ФСII – DCMU.

Как известно, ингибирование ФСII приводит к окислению пула пластохинонов, который, в основном, и определяет редокс-состояние хлоропластов.

Показано, что в регуляции экспрессии ядерного гена низкомолекулярного хлоропластного белка светового стресса Elip участвует редокс-состояние электронтранспортной цепи фотосинтеза. Изменение редокс-состояния хлоропластов, вызванное обработкой проростков ячменя DCMU (специфический ингибитор ФСII), приводит к снижению транскрипции гена Elip (на ~ 80%). Таким образом, в регуляции экспрессии гена хлоропластного белка светового стресса у ячменя участвуют не только тетрапирролы, но и другой класс пластидного сигнала, который индуцируется окисленным пулом пластохинонов.

Тот факт, что экспрессия ядерного гена белка Elip регулируется разными классами пластидных сигналов, свидетельствует о том, что экспрессия одного и того же гена может кооперативно регулироваться несколькими пластидными сигналами.

На основании вышеизложенного, нами предложена схема регуляции хлоропластами экспрессии ядерного гена хлоропластного белка светового стресса Elip (рис. 10).

Накопление промежуточных соединений биосинтеза хлорофилла (Mg-прото IX и его монометилового эфира) в оболочке хлоропластов приводит к снижению уровня экспрессии гена Elip. По-видимому, Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me поступают в цитозоль, и в ходе ряда последовательных реакций блокируют активатор/активирует репрессор транскрипции, что приводит к снижению уровня экспрессии этого гена. Возможна и регуляция экспрессии этого гена с участием редокс-равновесия электрон-транспортной цепи фотосинтеза. При блокировании транспорта электронов от ФСII к пулу пластохинонов происходит окисление пула пластохинонов, что коррелирует с падением уровня экспрессии гена Elip на 80%. Таким образом, можно говорить о функционировании при регуляции экспрессии гена Elip двух классов пластидно-ядерного взаимодействия. Первый класс предполагает участие Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me в инициации процессов, приводящих к изменению транскрипции этого гена. Поскольку в настоящее время не обнаружены последующие этапы пластидно-ядерного взаимодействия с участием Mg-прото IX и Mgпрото IX-Me (транскрипционные факторы, способные взаимодействовать с данными соединениями), эти тетрапирролы можно считать «медиаторами» пластидного сигнала.

ХЛОРОПЛАСТ DCMU тилакоиды свет ФС II PQ ФСI Синтез белка ALA PQHПрото Редокс-состояние электронтранспортной це пи Mg-прото Mg-прото Me рецепторы света клетка ЯДРО Elip Hsp Рис. 10. Схема участия разных классов пластидных Рис. 10. Схема участия разных классов пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых сигналов врегуляции экспрессии ядерных белков хлоропластов.

геновстрессовых белков хлоропластов.

Второй класс пластидно-ядерного взаимодействия осуществляется при непосредственном участии электрон-транспортной цепи фотосинтеза. Ингибирование транспорта электронов от ФСII к пулу пластохинонов в хлоропластах ячменя, в результате чего пул остается окисленным, вызывает понижение уровня транскриптов гена Elip.

Функционирование указанных двух классов пластидно-ядерного взаимодействия, приводящее к снижению уровня экспрессии ядерного гена белка светового стресса Elip, позволяет говорить о негативной регуляции экспрессии данного гена этими классами сигналов.

Выводы 1. Изучено влияние сигналов, генерируемых хлоропластами (пластидные или ретроградные сигналы) на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид (Elip, Hsp32) и генов белков фотосинтеза (Lhcb1, RbcS) в условиях фотодеструкции. Показано, что в изученных условиях пластидные сигналы ингибируют экспрессию генов белков фотосинтеза, частично подавляют экспрессию гена Elip и не влияют на экспрессию гена белка теплового шока Hsp32. Выявлены различия в регуляции экспрессии генов близкородственных белков Lhcb1 и Elip.

2. При фотодеструкции хлоропластов происходит накопление предшественников белков Elip и Hsp32 в оболочке пластид, что свидетельствует о нарушении импорта стрессовых белков в хлоропласты.

3. Показано, что в регуляции транскрипции гена Elip участвуют тетрапирролы, которые частично (на 50%) ингибируют экспрессию этого гена. Медиаторами пластидного сигнала служат промежуточные продукты биосинтеза тетрапирролов – Mgпротопорфирин IX и монометиловый эфир Mg-протопорфирина IX, которые подавляют экспрессию данного гена.

4. Показано, что неполное ингибирование диуроном восстановления пула пластохинонов приводит к существенному снижению уровня транскриптов Elip, что указывает на зависимость экспрессии ядерного гена белка светового стресса пластид от редокс-состояния электрон-транспортной цепи фотосинтеза.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»