WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Электрофорез и иммуноблоттинг. Электрофорез белков (10 мкг на дорожку) проводили в 12,5%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na по Лэммли (Laemmli, 1970). Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Schleicher and Schll», Германия) с размером пор 0,45 мкм (Towbin et al., 1979). Мембраны инкубировали в течение 1 ч при 4°С в блокирующем буфере:

5%-ное обезжиренное сухое молоко в 20 мМ Na-фосфатном буфере (рН 7,2), 0,15 М NaCl, 0,1%-ный Твин 20, и затем инкубировали с первичными антителами, разведенными 1:2000, к соответствующему белку (ELIP, HSP32, Lhcb1 или RbcS) в течение ночи при 4°С. Мембраны инкубировали 2 ч при комнатной температуре с антикроличьими IgG козы, конъюгированными с щелочной фосфатазой. Специфические белковые полосы обнаруживали с помощью субстратов для щелочной фосфатазы: 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат/нитросиний тетразолий.

Все эксперименты повторяли не менее трех раз.

Пептидные карты получали с помощью ограниченного протеолиза белков.

Переваривание белков в ПААГ проводили по методу Кливленда (Cleveland, 1983). Для переваривания использовали химотрипсин (20 мкг/мл) и протеазу М8 (16 мкг/мл).

Полипептиды, образовавшиеся при протеолизе, обнаруживали с помощью иммуноблоттинга.

Обработка хлоропластов трипсином. Осадок хлоропластов суспендировали в 0,5 мл буфера: 330 мМ сорбит, 50 мМ HEPES-KOH, pH 8,0, содержащего 20 мкг/мл трипсина (из поджелудочной железы быка; «Boehringer», Германия). Инкубацию с трипсином проводили в течение 15 мин во льду. Затем хлоропласты разбавляли 5 мл исходного буфера, содержащего ингибитор трипсина (20 мг/мл; яичный ингибитор трипсина, «Boehringer», Германия) или ингибиторы протеаз (1 мМ ФМСФ, 1 мМ бензамидин). Хлоропласты осаждали центрифугированием, и суммарные белки хлоропластов анализировали с помощью Ds-Na - ПАAГ электрофореза с последующим иммуноблоттингом.

Результаты и их обсуждение 1. Влияние фотодеструкции хлоропластов на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид. Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне мРНК у NF- обработанных растений Для обнаружения действия пластидного сигнала применяют методы ингибиторный анализ или анализ мутантов с нарушениями механизма передачи сигнала. При изучении влияния хлоропластов на экспрессию ядерных генов стрессовых белков использовали растения, у которых в результате фотодеструкции пластиды лишенны каротиноидов и внутренних структур. Проростки ячменя, выращенные в темноте в присутствии NF (ингибитора биосинтеза каротиноидов) освещали интенсивным светом, что приводит к фотоокислительному разрушению хлоропластов. В обесцвеченных пластидах отсутствует большинство внутренних структур, в числе которых тилакоидные мембраны и рибосомы;

ДНК и оболочка пластид повреждаются относительно мало. Анализ пигментного состава пластид показал отсутствие каротиноидов и хлорофиллов в растениях, обработанных ингибитором. В апикальной части контрольных проростков хлоропласты содержат регулярно организованные тилакоидные мембраны, в то время как в растениях, обработанных NF, пластиды апикальной части листьев почти лишены внутренней мембранной системы. Такие же повреждения ультраструктуры пластид в результате обработки этим соединением наблюдаются и в базальной части проростков ячменя. В контрольных растениях клетки содержат дифференцированные хлоропласты с типичной ультраструктурой, пластиды опытных растений полностью лишены внутренних мембран.

Исследование экспрессии четырех ядерных генов пластидных белков: двух генов стрессовых белков Elip и Hsp32 и двух генов белков фотосинтеза Lhcb1 и RbcS с помощью нозерн-гибридизации показало, что ген Hsp32 экспрессируется практически в одинаковой степени у контрольных и NF-обработанных растений, тогда как содержание транскриптов гена Elip снижено у опытных растений (рис. 1). Относительное содержание транскриптов в обработанных NF проростках составляло 50-70% и 90-95% от контроля для Elip и Hsp32, соответственно. Гены Lhcb1 и RbcS не транскрибируются у NF-обработанных растений.

Таким образом, показано, что в условиях фотодеструкции хлоропластов пластидные сигналы ингибируют экспрессию генов белков фотосинтеза, частично подавляют экспрессию гена Elip и не влияют на экспрессию гена белка теплового шока Hsp32. Выявлены различия в регуляции экспрессии генов близкородственных белков Lhcbи Elip.

NF + – + – + – + – а б Elip Hsp32 Lhcb1 RbcS Lhcb1= RbcS >Elip> HspТ Т в Elip Hsp32 Lhcb1 RbcS относительное содержание, % Рис. 1. Радиоавтограмма нозерн-блот гибридизации меченных Р Elip, Hsp32, Lhcbи RbcS с суммарной РНК NF-обработанных и контрольных растений ячменя - а; б – рРНК каждого из образцов, окрашенные EthBr, представленных в (а); в – относительное содержание (% от контроля) транскриптов Elip, Hsp32, Lhcb1, RbcS у проростков, обработанных норфлуразоном. – контроль, - опыт.

2. Обнаружение экспрессии генов стрессовых белков на уровне белка у NF- обработанных растений С помощью вестерн-блот анализа клеточных экстрактов NF-обработанных и контрольных проростков ячменя определяли содержание пластидных белков Elip, Hsp32, Lhcb1 и RbcS. Содержание белков Lhcb1 и RbcS понижено у NF-обработанных проростков по сравнению с контрольными растениями (рис. 2).

NF + – + – + – + – Elip Hsp32 Lhcb1 RbcS Рис. 2. Вестерн-блот анализ белков Elip, Hsp32, Lhcb1 и RbcS NF-обработанных и контрольных растений ячменя. 7-сут этиолированные проростки освещали (300 мкмоль м-с-1) в течение 24 ч. В опытах с Hsp32 проростки предварительно подвергали тепловому стрессу (42°С, 2 ч). Стрелками отмечены дополнительные белки.

Однако у обработанных NF проростков ячменя обнаружено накопление дополнительных, более высокомолекулярных, белков как в случае белка теплового шока Hsp32, так и белка светового стресса Elip. При совместном действии фотоокислительного стресса, вызванного ингибитором биосинтеза каротиноидов, и теплового стресса кроме зрелого Hsp32, обнаруживается дополнительный белок с молекулярной массой 36 кДа. В случае Elip кроме зрелого белка 13 кДа – белок с молекулярной массой 17 кДа (рис. 2).

Дополнительные белки обнаруживаются уже при 2-ч экспозиции проростков на свету и их содержание продолжает возрастать при увеличении продолжительности экспозиции на свету.

На примере белка теплового стресса Hsp32 показана динамика накопления предшественников белков (рис. 3).

Рис. 3. Иммуноблот-анализ содержания Hsp32 у NFобработанных (черный столбик – белок 36 кДа, серый столбик – Hsp32) и контрольных (белые столбики – белок 36 кДа, заштрихованные столбики – Hsp32) проростков ячменя. Проростки инкубировали 2 ч при 42° и затем освещали (300 мкмоль м-2 с-1) в течение 4 - 24 ч. Суммарные белки фракционировали с помощью Ds-Na-ПААГ электрофореза, после чего проводили иммуноблоттинг.

В растениях, подвергнутых только тепловому стрессу, накапливается зрелый белок Нsp32 (заштрихованные столбики), причем его содержание возрастает с увеличением продолжительности освещения до 12 ч. Следовое количество белка с молекулярной массой кДа также обнаруживается в этих препаратах, но его содержание не изменяется при освещении. В то время как в растениях, подвергнутых совместному действию теплового шока и окислительного стресса, содержание дополнительного белка 36 кДа увеличивалось линейно вплоть до 24 час экспозиции проростков на свету, содержание Hsp32 выходило на плато на ранних стадиях освещения (черные и серые столбики, соответственно).

Получены сходные пептидные карты для зрелого Нsp32 и дополнительного белка кДа (рис. 4).

Рис. 4. Пептидная карта Hsp32 и белка 36 кДа.

Переваривание белков химотрипсином проводили in situ. Пептиды обнаруживали с помощью вестерн-блот анализа. Белки выделяли из NF- обработанных (NF) и контрольных (K) проростков ячменя, освещенных в течение 24 ч.

Справа видны пептиды зрелого белка у NFобработанных проростков. Двусторонними стрелками обозначено положение пептидов, обнаруженных в обоих образцах. Пунктирной стрелкой отмечено положение предшественника белка Hsp32 у NF-обработанных проростков. М - зрелый белок, Р – предшественник.

Это указывает на высокую степень гомологии между этими белками и доказывает наличие взаимосвязи предшественник-продукт. Таким образом, показано, что в присутствии NF происходит накопление предшественника Нsp32. Другой возможностью показать связь предшественник-продукт для Hsp32 и белка 36 кДа является доказательство того, что при удалении NF содержание дополнительного белка (предположительно предшественника) уменьшается. Было показано, что через 16 час после удаления NF из среды с помощью двукратной отмывки корней растений водой содержание белка 36 кДа резко уменьшается (рис. 5).

Рис. 5. Действие удаления NF на содержание предшественника Hsp32. NF- обработанные (+) и контрольные (-) проростки ячменя подвергали тепловому шоку (42° С, 2 ч) и затем освещали 8 ч (300 мкмоль м-2 с-1). Корни растений отмывали, проростки переносили на воду и освещение продолжали в течение 16 ч. Белки выделяли из NFобработанных проростков (1,3), проростков, Тот факт, что обнаруживаются следовые количества этого белка, объясняется, видимо, неполной отмывкой корней от вермикулита, содержащего NF. Эти данные подтверждают, что белок 36 кДа является предшественником Hsp32. На рис. 6 представлено действие NF на содержание предшественника другого стрессового белка пластид Elip (13 кДа), кодируемого ядром и локализованного в тилакоидных мембранах. В этом случае наблюдается накопление более высокомолекулярного белка с молекулярной массой 17 кДа.

Рис. 6. Действие удаления NF на содержание предшественника Elip. NF- обработанные (+) и контрольные (-) проростки ячменя освещали 8 ч (мкмоль квантов м-2 с-1), затем корни растений отмывали, проростки переносили на воду и освещение продолжали в течение 16 ч. Белки выделяли из NFобработанных проростков (1,3), проростков, перенесенных на воду (4) и контрольных (2,5) 1 2 3 4 проростков ячменя.

Процесс накопления дополнительных белковых компонентов в присутствии NF является обратимым. Эти белки практически исчезают при отмывке корней растений от NF. Наличие нескольких минорных белковых иммунодетектируемых зон, наблюдаемых на рис. 5, объясняется тем, что в растениях имеется семейство белков Elip. На основании отличия по молекулярной массе, иммунологического сходства, пептидного картирования, а также опытов по удалению NF нами было установлено, что более высокомолекулярные белки являются предшественниками стрессовых белков Hsp32 и Elip.

Для того чтобы выяснить, где накапливаются предшественники стрессовых белков в клетках обработанных NF растений, очищенные в градиенте Перколла хлоропласты обрабатывали трипсином. Обнаружено, что предшественники белков чувствительны к действию трипсина, в то время как зрелые белки, прошедшие процессинг и находящиеся внутри пластид, не разрушаются при такой обработке органелл (рис. 7).

Рис. 7. Действие трипсина на хлоропласты из NF-обработанных (+) и контрольных (-) проростков ячменя. Переваривание трипсином (20 мкг/мл, 4° С, 15 мин) не импортируемых в пластиды белков. М – зрелые белки, Р – предшественники белков.

Это указывает на то, что часть предшественников стрессовых белков у NF-обработанных растений не проходит через мембрану оболочки, и позволяет считать, что накопление предшественников пластидных белков происходит за счет нарушения транслокации предшественников стрессовых белков в пластиды.

3. Влияние пластидных сигналов разных классов на регуляцию экспрессии ядерного гена пластидного белка Elip 3.1. Сигнальная роль интермедиатов биосинтеза тетрапирролов. Чтобы изучить участие тетрапирролов в регуляции транскрипции ядерного гена Elip, а именно - роль Mgпротопорфирина IX (Mg-прото IX) и его монометилового эфира – Mg-прото IX-Me в регуляции экспрессии ядерного гена низкомолекулярного пластидного белка Elip, были проведены опыты с 2,2’-дипиридилом. Дипиридил блокирует биосинтез тетрапирролов, локализованных в хлоропластах, на стадии превращения Mg-прото IX-Me в протохлорофиллид, что приводит к накоплению в хлоропластах Mg- прото IX- Me. В ходе измерения содержания интермедиатов биосинтеза хлорофилла обнаружено, что, по сравнению с контрольными растениями, количество Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me увеличивается в 5,8 раз в проростках, обработанных 2,2’-дипиридилом. Как видно из табл.

1, у NF-обработанных проростков ячменя также наблюдается повышенное содержание Mgпрото IX и Mg-прото IX-Me. По-видимому, негативная регуляция NF транскрипции генов белков хлоропластов может быть обусловлена накоплением интермедиатов биосинтеза тетрапирролов.

Таблица 1. Содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в проростках ячменя Содержание Mg-прото IX + Mg- прото IX-Me Вариант нмоль/г сырого веса % от контроля Контроль 0,073 ± 0,020 Норфлуразон* 0,116 ± 0,025 0,423 ± 0,024 2,2’- Дипиридил** * Проростки ячменя выращивали в темноте в течение 7 сут на растворе x 10-5 М NF или воде (контроль), а затем освещали в течение 24 ч.

** Проростки ячменя выращивали в темноте в течение 7 сут на воде, а затем на растворе мМ 2,2’-дипиридила или воде (контроль) в течение 8 ч на свету (30 мкмоль м-2 с-1).

Среднее значение получено из трех независимых экспериментов.

Это может объясняться тем, что синтез тетрапирролов до стадии протохлорофиллида локализован в окружающей мембране (оболочке) хлоропластов, а последующие стадии – во внутренних (тилакоидных) мембранах. При фотодеструкции в первую очередь разрушаются внутренние мембраны хлоропластов, в то время как оболочка остается неповрежденной, поэтому там накапливаются Mg-прото IX и Mg-прото IX-Me.

В результате анализа данных ОТ-ПЦР было обнаружено, что уровень экспрессии гена белка светового стресса хлоропластов в проростках, обработанных 2,2’-дипиридилом, ~ на 50% ниже, чем в контрольных растениях (рис. 8).

Т в К ДП Рис. 8. Содержание транскриптов ядерного гена стрессового белка Elip у контрольных растений и растений, обработанных 2,2’-дипиридилом (ДП). а - радиоавтограмма (нозернгибридизация), б – электрофореграмма суммарной РНК, окрашенной EthBr, в – относительное содержание (% от контроля) транскриптов гена Elip у проростков ячменя, обработанных 2,2’-дипиридилом. К-контроль.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»