WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Исследование кинетических характеристик Lc1 и Lc2 позволило выявить некоторые различия в кинетических параметрах данных ферментов (Таблица 2). Наблюдались значительные различия эффективности каталитического окисления и сродства к разным субстратам Lc1 и Lc2 несмотря на их принадлежность к одной окислительно-восстановительной группе – высокоредокс-потенциальных лакказ. Это может служить примером усложнения регуляции процесса деградации лигнина. Например, низкое сродство при высокой специфичности системы (конститутивные формы Lc, подобно Lc1 и Lc2 базидиомицета T. pubescens) необходимо при наличии низкого уровня субстрата. В то время как высокое сродство при низкой специфичности системы (индуцируемые формы лакказ) необходимо в случае избытка субстрата. Таким образом, наличие множественных форм ферментов, вероятно, является необходимым эволюционным ответом на способность грибов белой гнили деградировать твердый жесткий субстрат (лигнин) в различных условиях окружающей среды, которые могут изменяться в течение жизненного цикла грибов.

На основании результатов масс-спектрометрических исследований можно предположить, что Lc1 и Lc2 представляют собой два продукта одного гена, т.е.

являются конститутивными множественными формами одного фермента, которые образуются в результате пост-трансляционной модификации белка.

Интересно было также исследовать возможные взаимосвязи, возникающие между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens. Первоначально необходимо было ответить на вопрос: что может обеспечивать наличие синергетического действия основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиальных грибов Из литературных данных известно, что наличие ионов металлов (особенно, марганца, меди и железа) в древесине является необходимым условием для нормального функционирования грибных окислительновосстановительных ферментов. Именно Mn (II) является основным субстратом MnP, а также может играть значительную роль в каталитическом цикле LiP.

Недавние исследования показали, что Mn (II) является также нетипичным субстратом Lcs базидиальных грибов и может обеспечивать наличие кооперативного действия Lc и MnP.

Мы предположили, что изучение согласованного действия основных ферментов лигнинолитического комплекса (Lc, LiP и MnP) на примере базидиомицета T. pubescens в присутствии ионов марганца, как природного медиатора, может помочь прояснить ферментативный и неферментативный механизмы деградации лигнина грибами белой гнили. Как было показано, данный металл действительно может играть роль связующего звена между тремя основными ферментами лигнинолитического комплекса базидиального гриба T. pubescens.

Методом циклической вольтамперометрии доказана возможность протекания ферментативной реакции окисления ионов Mn (II) высокопотенциальными Lcs базидиальных грибов в присутствии хелатирующих агентов (анионов органических кислот). Были определены условия протекания (насыщающая концентрация фермента и субстрата (Mn (II)), подобраны хелатирующие агенты и рН буферного раствора) и исследованы продукты данной реакции. Показано, что образование Mn3+тартратного или Mn3+-оксалатного комплекса в ходе ферментативного окисления запускает цепь реакций, ведущих к возможному образованию супероксиданион-радикала, и, в конечном итоге, пероксида водорода.

Действительно, из литературных источников известно, что окисление анионов органических кислот (щавелевая, глиоксалевая и яблочная кислоты) ионами Mn(III) может являться одним из путей образования внеклеточного пероксида водорода. Например, установлена следующая последовательность реакций, протекающих при окислении щавелевой кислоты:

Mn3+ + COOH-COOH = Mn2+ + CO2 - + CO2 + 2H+ CO2 - + O2 = O2– + COO2– + Mn2+ + 2H+ = Mn3+ + H2OO2– + H+ = H2O2 + O Пероксид водорода, в свою очередь, может участвовать в качестве окислительного субстрата для основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиальных грибов. Этот путь является одним из возможных путей образования внеклеточного пероксида водорода.

Таким образом, в настоящей работе мы подтвердили схему кооперации лакказы и MnP, предложенную ранее немецкой группой ученых [Schlosser and Hofer, 2002], дополнив и расширив ее на все основные ферменты лигнинолитического комплекса базидиального гриба T. pubescens: Lc, LiP и MnP (Рисунок 6).

Рисунок 6. Предполагаемая схема взаимодействия основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Trametes pubescens (пояснения в тексте).

Наличие прочного комплекса, образуемого Lc и LiP (или MnP, в зависимости от условий культивирования), позволяет предположить следующую схему кооперации лигнинолитических ферментов базидиомицета T. pubescens. Lc катализирует окисление ионов Mn2+ молекулярным кислородом в присутствии анионов органических кислот. В результате реакции образуется комплекс Mn(III) с анионами органических кислот, который участвует в серии неферментативных процессов, ведущих к образованию пероксида водорода.

Последний, в свою очередь, может использоваться в качестве окислительного субстрата, как LiP, так и MnP.

Кроме того, высокий редокс-потенциал хелатированной пары Mn2+/Mn3+ позволяет также непосредственно окислять нефенольные подструктуры лигнина, например, вератровый спирт, а в присутствии Lc пара Mn2+/Mn3+ может выполнять роль усилителя действия фермента. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о существенно более важной роли Lcs в составе лигнинолитического комплекса при разрушении древесины, чем предполагалось ранее.

На заключительном этапе работы была показана принципиальная возможность использования лигнинолитических ферментов гриба T. pubescens в биотехнологии. Разработан амперометрический биосенсор на основе частично очищенного препарата культурального фильтрата гриба T. pubescens для определения соединений фенольной структуры, который имел более широкий линейный диапазон детекции для большинства использованных субстратов.

ВЫВОДЫ 1. Выделены в гомогенном состоянии и детально охарактеризованы две новые, ранее не описанные множественные формы лакказы базидиомицета Trametes pubescens. Впервые получены в гомогенном состоянии и частично охарактеризованы лигнинпероксидаза и марганецпероксидаза базидиального гриба Trametes pubescens.

2. Показано сходство биохимических, спектральных и электрохимических характеристик лакказы 1 и лакказы 2 базидиомицета Trametes pubescens между собой и другими высокопотенциальными лакказами.

Однако две множественные формы лакказы гриба Trametes pubescens имеют различное значение эффективности каталитического окисления и сродства к разным субстратам.

3. Электрохимически доказана возможность протекания реакции каталитического окисления ионов двухвалентного марганца высокопотенциальными лакказами базидиальных грибов в присутствии хелатирующих агентов (анионов тартрата и оксалата). Предложена расширенная схема кооперации ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens.

4. На основе частично очищенного препарата культурального фильтрата базидиомицета Trametes pubescens разработан амперометрический биосенсор для определения соединений фенольной структуры, который имеет широкий линейный диапазон детекции для большинства использованных фенольных соединений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ 1. Shleev S.V., Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serezhenkov V.A., Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes.

(2004) Biochimie, 86, 693-703.

2. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С. Русинова Т.В., Сереженков В.А., Бурбаев Д.Ш., Беловолова Л.В., Ярополов А.И. Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach.) Pilt и исследование их свойств. (2005) Биохимия. Т. 70, вып. 11, с. 1548-1555.

3. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С. Русинова Т.В., Ярополов А.И. Роль ионов двухвалентного марганца в функционировании лигнинолитических ферментов базидиального гриба Trametes pubescens. (2005) Вестн. Моск. Ун-та, Сер. 2. Химия. Т. 46, № 4, с. 272-278.

4. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Ярополов А.И. Лакказа базидиального гриба Trametes pubescens // Тезисы докладов международной конференции 8-ой Международной Пущинской Школы-Конференции “Биология - наука XXI века”, 17-21 Май 2004, Пущино, Россия, С. 272.

5. Никитина О.В., Русинова Т.В., Шлеев С.В. Ионы двухвалентного марганца – нетипичный субстрат лакказы базидиального гриба Trametes pubescens // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2005». Секция «Химия», т. 1, 12 – 15 апреля, Москва, 2005, С. 94.

6. Nikitina O.V., Shleev S.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V. and Yaropolov A.I. A role of Mn2+ in the function of ligninolytic enzymes from Trametes pubescens basidiomycete // International Conference Fundamentals & Applications “Biocatalysis – 2005”, June, 19 – 23, 2005, C. 95.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»