WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Проведено сравнительное изучение биоэлектрокаталитических свойств Lcs базидиомицета T. pubescens. В присутствии субстрата фермента, молекулярного кислорода, показана возможность прямого электронного переноса с электрода на молекулу фермента с последующим электрокаталитическим восстановлением дикислорода на графитовых электродах. При адсорбции на электродах обе формы лакказы сильно снижают потенциал, необходимый для электровосстановления молекулярного кислорода до воды. Электрокаталитический ток электродов, модифицированных Lc1 и Lc2, регистрировался уже при потенциале около + 870 мВ со значением потенциала полуволны электровосстановления дикислорода +745 мВ и +735 мВ для Lc1 и Lc2, соответственно.

Исследована зависимость плотностей электрокаталитических токов от значения рН раствора в области рН 2,5 – 6,0. Показано, что рН-зависимости электровосстановления молекулярного кислорода для двух форм Lcs очень близки как в случае ферментов, адсорбированных на электродах, так и в случае гомогенного катализа.

Для двух форм ферментов (Lc1 и Lc2) показано ингибирование электрокаталитической активности галогенид-ионами (за исключением иодиданионов), что хорошо согласуется с литературными данными. Также нами были изучены каталитические параметры биоэлектрохимических реакций, в частности зависимость скорости биоэлектрохимической реакции от концентрации растворенного молекулярного кислорода.

Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделать вывод о значительном сходстве биохимических, физико-химических, а также электрохимических свойств обоих форм лакказ. Для выяснения вопроса о том, являются ли выделенные ферменты продуктами одного гена, были проведены масс-спектроскопические исследования Lc1 и Lc2.

Анализ гидролизатов Lc1 и Lc2 методом MALDI в области масса/заряд (m/z) 500–5000 показал практически полное сходство аминокислотных последовательностей данных белков (рисунок 4). Исходя из этого можно предположить, что выделенные ферменты Lс1 и Lс2 являются, скорее всего, продуктами одного гена, т.е. множественными формами одного и того же фермента. Для сравнения был проведен аналогичный анализ ранее изученной Lc Trametes hirsuta. Продукты гидролиза этого фермента сильно отличались от таковых у исследуемых и охарактеризованных Lс1 и Lс2 базидиомицета T.

pubescens. Следует отметить, что пять полученных пептидов Lc1 и Lcсовпадали с основными пептидами Lc Trametes versicolor. При этом аминокислотная последовательность Lc1 и Lc2 отличалась от данных, имеющихся в литературе по первичной структуре двух изоформ лакказ T.

pubescens (база данных NCBI, AAM18408 и AAM18407). Таким образом, выделенные нами ферменты являются новыми, ранее не описанными множественными формами Lc T. pubescens.

Рисунок 4. Суммарный масс-спектрометрический анализ продуктов гидролитического расщепления Lс1 и Lс2.

Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов гриба Trametes pubescens при деградации модельных соединений лигнина.

Как было сказано выше, Lc2, в отличие от Lc1, образует весьма прочный комплекс с LiP или же MnP (в зависимости от условий культивирования) и ее достаточно сложно получить в гомогенном состоянии. Это обстоятельство, а также большое сходство свойств двух форм Lcs определили выбор объекта наших дальнейших исследований. В последующих экспериментах использовали в основном препарат Lc1, однако для сравнения результатов и контрольных экспериментов использовали оба препарата Lcs (Lc1 и Lc2) базидиомицета T. pubescens.

Одной из задач нашей работы являлось исследование возможных взаимосвязей, возникающих между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens. Ранее было показано, что Lc из базидиомицета T. versicolor катализировала окисление ионов Mn2+ до Mn3+ в присутствии хелатирующего агента – Na-пирофосфата.

Использование анионов оксалата и малоната в качестве комплексонов трехвалентного марганца приводило к образованию супероксиданион-радикала с последующим его превращением в Н2О2. Была также предложена схема взаимодействия Lc и MnP. В этой связи важным представляется выявление возможности протекания этих реакций с Lcs из других источников для установления роли этого фермента при функционировании лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов.

Одним из основных параметров, от которого зависит скорость окисления субстратов Lc, является различие в потенциалах донора и первичного акцептора электронов фермента. Как было показано выше, Lcs базидиомицета T. pubescens можно отнести к группе высоко-редокс-потенциальных ферментов, так как значение ОВП Т1 центра для обоих ферментов составляло около мВ, в то время как редокс-потенциал пары Mn2+/Mn3+ (аква-комплекс) составляет 1100 мВ. Таким образом, высокая разность в значениях редокспотенциалов делает термодинамически невозможным процесс окисления ионов Mn(II) Т1 центром Lcs. Однако, образование комплексов марганца с хелатирующим агентом (например, анионом дикарбоновых или – оксикарбоновых кислот) может значительно понижать редокс-потенциал этой пары. Это было показано прямым электрохимическим экспериментом.

На рисунке 5 представлена циклическая вольтамперограмма, записанная с использованием стеклоуглеродного электрода в Na-тартратном буферном растворе, содержащем ионы Mn2+. Потенциал средней точки, равный +940 мВ, соответствует ОВП тартратного комплекса пары Mn2+/Mn3+. При более положительных потенциалах наблюдалось некоторое необратимое окисление аква-комплекса Mn2+ вплоть до потенциала 1100 мВ. По-видимому, существует равновесие между ионами марганца в составе водного комплекса и ионами металла, хелатированными тартрат-анионами, и только последние могут принимать участие в ферментативной реакции. При этом равновесие смещено в сторону водного комплекса ионов марганца.

Таким образом, полученное экспериментальным путем значение редокспотециала тартратных комплексов марганца указывает на термодинамическую возможность их медленного окисления высокоредокс-потенциальными Lcs базидиальных грибов. Для проверки данного предположения была спектрофотометрически изучена реакция ферментативного окисления ионов Mn2+, катализируемая Lc1 гриба T. pubescens, в присутствии хелатирующих агентов (анионов тартрата и оксалата).

Е = + 990 мВ р.а.

Е = + 890 мВ -р.с.

200 400 600 800 1000 E / мВ (vs. NHE) Рисунок 5. Циклические вольтамперограммы, записанные на стеклоуглеродном электроде, в присутствии (1) и в отсутствии (2) 0,2 мМ MnSO4 в 0,1 М тартратном буфере (скорость сканирования - 50 мВ/с;

начальный потенциал 210 мВ).

Исследование зависимости начальной скорости гомогенной каталитической реакции от концентрации ионов Mn2+ в стационарных условиях показало, что кинетика реакции хорошо описывается классическим уравнением Михаэлиса-Ментен. Однако, эффективность ферментативного процесса (kкат/КМ = 0,043 мМ-1с-1) при окислении ионов Mn2+ в присутствии анионов татрата существенно ниже, чем при окислении традиционных субстратов Lcs (таблица 2). Обращает на себя внимание тот факт, что оптимум рН реакции окисления ионов Mn2+ сдвинут в нейтральную область, по сравнению с типичными субстратами Lcs, и находится в интервале рН 5,5 – 6,0.

Исследованы продукты реакции ферментативного окисления ионов Mn2+ Lcs гриба T. pubescens в присутствии анионов оксалата или тартрата в качестве I, А хелаторов. Показано, что одним из продуктов реакции являлся пероксид водорода. Кроме того, возможное присутствие супероксиданион-радикала косвенно показано по восстановлению нитросинего тетразолия в системе, содержащей Lc, Na-оксалатный или Na-тартратный буфер и ионы Mn2+.

Участие супероксиданион-радикала во вторичных химических реакциях или же его диспропорционирование в растворе приводит к образованию пероксида водорода.

Таким образом, в результате проведенных исследований доказана возможность протекания и изучена реакция окисления ионов Mn2+, катализируемая Lcs базидиомицета T. pubescens, в присутствии хелатирующих агентов. Аналогичные результаты были получены с использованием Lc другого базидиального гриба T. hirsuta. На основании литературных данных и проведенных исследований можно предположить, что указанная реакция характерна для большинства Lcs базидиальных грибов.

Было показано, что в реакционной смеси, содержащей Lc, MnP, Mn2+ и хелатор, без добавления Н2О2, наблюдалось резкое увеличение скорости образования комплекса Mn(III) с тартрат-анионом. В отсутствие Lc эта реакция не протекает, то есть Lc действительно может являться инициатором MnP- и LiP-реакций.

Высокий редокс-потенциал хелатированной пары Mn2+/Mn3+ позволяет также проводить непосредственное окисление нефенольных подструктур лигнина, например, вератрового спирта. Методом циклической вольтамперометрии показано, что в присутствии ионов Mn2+ и хелатора наблюдалось увеличение анодного тока на 25% в области потенциалов окисления Mn(II) по сравнению с фоновой реакцией. То есть окисление вератрового спирта происходило с меньшим перенапряжением, чем при прямой электродной реакции. Помимо электрохимических экспериментов в работе было проведено спектрофотометрическое детектирование ферментативного окисления вератрового спирта Lcs T. pubescens в присутствии комплекса Mn(II).

В процессе реакции наблюдалось увеличение оптической плотности в области 310 нм – максимуме поглощения вератрового альдегида, основного продукта окисления вератрового спирта.

Заключительным этапом нашей работы являлось исследование возможности использования выделенных и охарактеризованных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens при создании биосенсора для анализа фенольных соединений.

Разработка амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе ферментного препарата базидиомицета Trametes pubescens.

В настоящей работе при создании биосенсора использовали частично очищенный ферментный препарат лакказ базидиомицета T. pubescens.

Оптимизацию амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе ферментного препарата из гриба T. pubescens проводили при использовании пирокатехина в качестве модельного субстрата ферментов. В качестве рабочего электрода использовали спектральный графит с нанесенным на его поверхность ферментным препаратом. Детекцию осуществляли при потенциале рабочего электрода, соответствующего электровосстановлению продукта ферментативной реакции. Показано, что оптимальная концентрация ферментного препарата для адсорбции составляла около 100 мкг/мл. Воспроизводимость результатов для шести изготовленных ферментных электродов составляла приблизительно 88%, что хорошо согласуется с литературными данными для биосенсоров на основе лакказамодифицированных электродов.

Исследована зависимость изменения отклика биосенсора от приложенного потенциала. Показано, что для потенциалов ниже +385 мВ ток пика не зависит от приложенного потенциала. В дальнейших экспериментах электровосстановление окисленных фенольных соединений проводили при потенциале +160 мВ, так как этот потенциал удобен для практического использования и оказывает наименьшее влияние на превращение различных соединений в комплексных системах. Наиболее интенсивный ответ биосенсора наблюдался при скорости потока 0,5 мл/мин. Изучение влияния рН буферного раствора на отклик биосенсора показало, что оптимальное значение рН для детекции пирокатехина составляло 5,0.

В оптимизированных условиях были определены амперометрические отклики биосенсоров на основе ферментного препарата из гриба T. pubescens с использованием проточно-инжекционной системы для ряда фенольных соединений. Чувствительность, предел детекции, линейный динамический диапазон, а также коэффициент корреляции рассчитывали, используя уравнение Михаэлис-Ментен для электрохимических систем. Характеристики биосенсоров на основе ферментного препарата из гриба T. pubescens представлены в таблице 3.

Таблица 3. Характеристики амперометрических биосенсоров на основе ферментного препарата базидиомицета Trametes pubescens по отношению к фенольным соединениям.

Наклон Линейный Предел Коэффициент калибровочной диапазон детекции Фенольное корреляции соединение кривой детекции (nA M-1) (M) (M) (r) Фенол 0,06 1-25 17,1 0,п-Крезол 0,39 1-50 8,3 0,L-ДОФА 1,34 1-75 11,4 0,Ванилин 1,56 1-10 16,4 0,Конифериловый 1,60 1-75 9,5 0,альдегид Допамин 1,99 1-25 20,6 0,Гваякол 2,35 10-100 7,3 0,Пирокатехин 2,87 1-25 26,0 0,ДОФУК 3,35 1-10 10,4 0,Гидрохинон 5,06 1-10 23,1 0,Сравнивая полученные нами данные для электродов, модифицированных ферментными препаратами из базидиомицета T. pubescens, с известными литературными данными для электродов, модифицированных лакказами T.

versicolor и T. hirsuta, можно сделать вывод, что разработанный биосенсор обладал более широким линейным диапазоном детекции для большинства использованных фенольных соединений (таблица 3).

ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенных исследований разработана схема очистки лигнинолитических ферментов базидиального гриба T. pubescens. Показано, что использованный в настоящей работе штамм базидиомицета T. pubescens 923-при выбранных условиях культивирования продуцировал в детектируемых количествах следующие лигнинолитические ферменты: две формы лакказы (Lc1 и Lc2), LiP и MnP, которые были выделены и очищены до гомогенного состояния. Проведено комплексное исследование оксидоредуктаз базидиомицета T. pubescens, включающее изучение биохимических, спектральных, каталитических и электрохимических свойств ферментов.

Основное внимание в работе уделяли изучению Lcs базидиомицета T.

pubescens, так как Lc является одним из основных ферментов утилизации лигнина. Наши исследования показали сходство биохимических, спектральных и электрохимических параметров Lc1 и Lc2. Определены ОВП Т1 ионов меди обоих форм ферментов, последние были отнесены к группе высокоредокспотенциальных Lcs. Обе формы Lc катализировали реакции электровосстановления молекулярного кислорода, протекающего по четырехэлектронному безмедиаторному механизму. Результаты электрохимических экспериментов по электровосстановлению молекулярного кислорода (гетерогенная система) хорошо согласуются с результатами гомогенной кинетики ферментативного восстановления дикислорода.

Результаты электрохимических экспериментов подтверждают ранее предложенный механизм функционирования лакказы на угольных электродах.

Впервые было показано, что данный механизм справедлив в отношении множественных форм лакказ, выделенных из одного штамма базидиомицета.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»