WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Приготовление электродов. Исследования проводили на электродах двух типов: спектроскопическом графитовом электроде (Ringsdorff Werke GmbH, Bonn, Germany) и стеклоуглеродном электроде фирмы “BAS”. Поверхность стеклоуглеродного рабочего электрода перед экспериментами полировали Al2O3, затем промывали деионизированной водой. Поверхность спектроскопического графитового электрода полировали на влажной наждачной бумаге (Tufback Durite P1200), промывали бидистиллированной водой и высушивали. Модификацию графитового электрода осуществляли следующим образом: каплю раствора лакказы (10 мкл; 0,7 мг/мл) или препарата культурального фильтрата наносили на полированную поверхность электрода и оставляли в течение 20 минут для адсорбции, избыток фермента(ов) осторожно смывали деионизированной водой.

Циклические вольтамперограммы записывали с использованием вольтамперометрического анализатора CV-50W фирмы “BAS” (США) с использованием трехэлектродной электрохимической ячейки в широком интервале потенциалов и при варьировании скорости сканирования.

Амперометрические исследования биосенсоров проводили с использованием трехэлектродного потенциостата (Zata Electronics, Лунд, Швеция) в проточно-инжекционной системе. В качестве рабочего электрода использовали модифицированный спектроскопический графитовый электрод.

Поток создавали с помощью перистатического насоса Gilson (Франция) 0,1 М растворами цитрат-фосфатного буфера. Анализируемую пробу объемом 50 мкл вносили в поток, используя шестиканальный инжектор ((LabPRO Rheodyne injection, PR700-100-01, Rheodyne, США). Регистрацию данных осуществляли с помощью самописца (Kipp and Zonen, тип BD111, Delft, Нидерланды).

Электродом сравнения во всех случаях являлся AgAgCl3М NaCl электрод (BAS, 210 мВ vs. NHE), а вспомогательным электродом служила платиновая проволока диаметром 1 мм.

Определение окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) Тцентра лакказы осуществляли методом редокс-титрования, используя октоцианомолибдат (IV) калия в качестве медиатора. Электрохимическое потенциометрическое титрование вели в спектроэлектрохимической ячейке, (золотой капилляр с рабочим объемом 0,7 мкл), потенциал которого контролировали с помощью трехэлектродного потенциостата BAS LC-3E. В данных исследованиях насыщенный хлорсеребряный (AgAgClKClsat; 200 мВ vs. NHE) и платиновый электроды использовались в качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода, соответственно. Спектр поглощения регистрировали с помощью PC2000-UV-VIS и миниатюрного оптоволоконного спектрометра Ocean Optics (Dunedin, FL, USA).

Все потенциалы в работе приведены относительно нормального водородного электрода (vs. NHE), рН 7,0; 25С.

В третьей главе представлены собственные результаты.

Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Trametes pubescens.

Сравнительное исследование качественного состава ферментов лигнинолитического комплекса при глубинном культивировании базидиомицета T. pubescens, штамм 923-2, на базовой глюкозо-аммонийной среде с кукурузным экстрактом и на комплексной среде (мелассе) показало, что в первом случае продуцировались значительные количества Lc- и LiPактивностей и обнаруживались лишь следовые количества MnP-активности. В то время как при глубинном культивировании того же штамма гриба на мелассе наблюдался максимум MnP и Lc-активностей, а LiP-активность практически не детектировалась. Поэтому для выделения основных лигнинолитических ферментов гриба T. pubescens (Lc, LiP и MnP) были использованы культуральные фильтраты двух типов, полученные при выращивании данного штамма гриба на вышеописанных средах.

Для изучения физико-химических и биохимических характеристик ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens разработан метод получения ферментов в количествах, достаточных для решения поставленных в работе задач. Он включал в себя следующие стадии:

осаждение белков из культуральной жидкости сульфатом аммония в диапазоне насыщения 0-90% и ионообменную хроматографию низкого давления на носителях Сервацел ДЕАЕ 52 и Toyopearl DEAE 650М. В результате был получен препарат «голубой» лакказы (в дальнейшем Lc1), а также комплекс ферментов, обладающих оксидазной и пероксидазной активностями, для разделения которых была разработана схема очистки, представленная на рисунке 1. Комплекс ферментов удалось разделить введением дополнительных стадий очистки с использованием гельфильтрационной, адсорбционной и гидрофобной хроматографии. В результате, после стадий гидрофобной хроматографии, были получены гомогенные препараты двух форм Lcs: Lc1 с удельной каталитической активностью (Ауд) – 75,1 мкмоль/мин на 1 мг белка и общим выходом по активности (по пирокатехину) в результате очистки – 10,7%, и Lc2 с Ауд = 66,7 мкмоль/мин на 1 мг белка и общим выходом по активности (по пирокатехину) в результате очистки – 14,6%; а также LiP или MnP, в зависимости от типа исходного культурального фильтрата. LiP и MnP имели следующие удельные каталитические активности: 15,5 мкмоль/мин на мг белка и 40,0 мкмоль/мин на 1 мг белка соответственно.

Рисунок 1. Схема очистки ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens.

Осаждение белков из культуральной жидкости (NH4)2SO4 (0-90%) Ионообменная хроматография на носителях:

Сервацел ДЕАЕ 52 и Toyopearl ДЕАЕ 650М Комплекс лакказа/пероксидаза Гидрофобная Гель-фильтрация на колонке Bio хроматография Sep-SEC-S 2000 “Phenomenex” (Phenyl Sepharose) Адсорбционная хроматография на носителе Bio-Gel HTP Лакказа Гидрофобная хроматография (Phenyl Sepharose) Лигнинпероксидаза Лакказа или Марганецпероксида Таким образом, использованный в настоящей работе штамм гриба T.

pubescens 923-2 при соответствующих вышеописанных условиях культивирования продуцировал три лигнинолитических фермента: Lc, LiP и MnP. Из образцов культурального фильтрата в гомогенном состоянии были выделены две формы Lc, а также впервые получены гомогенные препараты LiP и MnP. Было показано, что Lc2, в отличие от Lc1, образует весьма прочный комплекс с LiP или же MnP (в зависимости от условий культивирования), который удавалось разрушить только с использованием гидрофобного носителя на последней стадии очистки.

Физико-химические свойства ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens.

Выделенные препараты ферментов изучали в сравнении с другими известными ферментами по следующим параметрам: молекулярная масса, изоэлектрическая точка, состав и строение углеводной части, спектральные характеристики ферментов.

Показано, что Lc1 и Lc2 базидиомицета T. pubescens представляли собой мономерные белки с близкой молекулярной массой около 67 кДа. Обе выделенные Lcs являлись гликопротеинами, их углеводная часть составляла приблизительно 13% от массы белка. В состав углеводной части Lc T. pubescens входили: N-ацетил-глюкозамин, манноза и ксилоза. Показано, что среднее содержание меди в молекулах Lc1 и Lc2 гриба T. pubescens составляло 3,9 и 3,иона металла на одну молекулу белка, соответственно, что является типичным значением для «голубых» оксидаз.

LiP имела молекулярную массу 45 кДа, а молекулярная масса MnP составляла 54 кДа. Изученные Lc1, Lc2 и LiP являлись кислыми белками с изоэлектрическими точками 5,3; 5,1 и 4,2 соответственно. Основные биохимические характеристики лигнинолитических ферментов базидиомицета T. pubescens представлены в таблице 1.

Таблица 1. Основные биохимические характеристики гомогенных препаратов ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Trametes pubescens Удельная активность Углеводная MW Фермент (мкмоль/мин на мг pI часть (кДа) белка) (%) Lc1 66,7* 67 ± 2 5,3 ± 0,1 Lc2 75,1* 67 ± 2 5,1 ± 0,1 LiP 15,5** 45 ± 2 4,2 ± 0,1 н.о.

MnP 40,0*** 54 ± 2 н.о. н.о.

Примечания: Результаты рассчитаны как среднее значение по трем измерениям; н.о. – параметр не определяли. MW – молекулярный вес. * – активность по пирокатехину, ** – активность по вератровому спирту, *** – активность по MnSO4.

Для выяснения строения активного центра оксидоредуктаз базидиомицета T. pubescens были проведены спектральные исследования ферментов. Спектры поглощения Lc1 и Lc2 типичны для нативных «голубых» Lcs базидиальных грибов, и в них присутствовали сигналы обоих центров меди, а именно Т1 (пик 610 нм) и Т3 (плечо в области 330 нм). Спектры поглощения LiP и MnP типичны для гем-содержащих ферментов и характеризовались ярко выраженными максимумами поглощения в области 407 нм и 403 нм, соответственно (полоса Соре), а также полосами поглощения в областях 500 нм и 635 нм.

В спектре ЭПР LiP наблюдался сигнал при g 6,0, характерный для высокоспинового иона железа (Fe3+) в гем-содержащих ферментах. Для Lc1 и Lc2 получены близкие спектры ЭПР, типичные для «голубых» Lcs. Рассчитаны значения компонент g- тензора и А-тензора: для Т1 центра: g|| = 2,20, А|| = 90.10см-1 и для Т2 центра: g|| = 2,25, А|| = 188.10-4 см-1.

Изучение вторичной структуры ферментов проводили с помощью спектроскопии кругового дихроизма. Показано, что Lc1 и Lc2 имели незначительные отличия во вторичной структуре белка, в то время как КДспектр LiP значительно отличался от двух спектров лакказ. Он имел четкий максимум поглощения при 210 нм и плечо в области 222 нм, что хорошо согласуется с литературными данными.

КД-спектры лакказ базидиомицета T. pubescens были математически обработаны в области длин волн от 190 до 250 нм. Параметры вторичной структуры белков были рассчитаны с использованием компьютерной программы «Protein-CD», версия 1,5. Программа сравнивает КД-спектры интересующих нас ферментов (Lc1 и Lc2) с КД-спектрами имеющихся в базе данных белков. Наилучшая корреляция КД-спектров исследуемых ферментов (Lc1 и Lc2) с КД-спектрами, имеющимися в базе данных, была получена для кластера, состоящего из 18 белков с известной вторичной структурой.

Результаты расчетов показали, что обе формы Lc содержат около 2-3% спиральных участков, 45-46% -структуры, 20% изгибов и 33-34% представлено нерегулярной структурой.

Таким образом, в результате проведенных исследований, были детально охарактеризованы основные физико-химические свойства двух форм Lcs, а также частично исследованы гомогенные препараты ферментов LiP и MnP.

Показано сходство биохимических и спектральных параметров двух форм Lcs с лакказами других базидиальных грибов.

Сравнительные исследования двух множественных форм лакказ базидиомицета Trametes pubescens.

Ввиду того, что лакказа является одним из основных ферментов, необходимых для деградации лигнина, интересно было провести детальные сравнительные исследования физико-химических свойств лакказ T. pubescens.

Изучены зависимости начальной скорости гомогенной каталитической реакции от концентрации различных субстратов Lc в стационарных условиях. В таблице 2 представлены значения каталитических констант (kкат) ферментативных реакций по различным субстратам-донорам для Lc1 и Lc2, значения констант Михаэлиса (КМ), а также отношение этих величин, характеризующее эффективность каталитического процесса. Как видно из таблицы 2, Lc2 обладала более высокими значениями каталитических констант по отношению к нефенольным субстратам (ABTS, K4Fe(CN)6), в то время как Lc1 обладала высокими скоростями окисления субстратов фенольной структуры (гидрохинон и гваякол). При этом, сродство Lc1 по отношению к гидрохинону ниже такового по сравнению с Lc2, тогда как эффективность каталитической реакции окисления пирокатехина выше для Lc1 за счет низкого значения константы Михаэлиса (Таблица 2).

Оптимум рН обеих Lcs практически совпадал и находился в интервале 4,– 4,5 при использовании пирокатехина в качестве субстрата ферментов. В присутствии K4Fe(CN)6 активность ферментов при возрастании рН раствора от 2,5 до 6,0 сначала практически не изменялась, а затем монотонно падала.

При инкубации Lc1 базидиомицета T. pubescens при 37С фермент терял лишь около 25% от своей первоначальной активности за 72 часа, в то время как лакказа из широко описанного в литературе базидиомицета Trametes hirsuta теряет около 40%. Таким образом, Lc1 гриба T. pubescens весьма термостабильна, что делает привлекательным ее возможное использование в биотехнологических процессах.

Таблица 2. Кинетические параметры Lc1 и Lc2 базидиомицета Trametes pubescens Lc1 LcСубстрат КM kcat kcat/КM КM kcat kcat/КM (мМ) (с-1) (с-1мМ-1) (мМ) (с-1) (с-1мМ-1) Гидрохинон 0,50 240 480 0,20 170 Пирокатехин 0,20 60 300 0,60 160 Гваякол 0,22 136 620 0,12 55 АБТС 0,05 150 3000 0,06 400 K4Fe(CN)6 0,70 280 400 0,20 370 Примечания: кинетические константы были рассчитаны как средние значения по трем измерениям, ошибка измерения не превышала 10%. Условия:

0,1 М цитрат-фосфатный буфер, рН 4,5; 20°С.

Рисунок 3. Спектроэлектрохимическое окислительновосстановительное титрование лакказ Trametes pubescens (0,022 мM Lc1 и 0,018 мM Lc2; 0,2 мM K4Mo(CN)6; 100 мM фосфатный буфер, pH 6,5).

(A) Изменение спектра поглощения Lс1 в процессе редокс-титрования.

1 – 5 спектры поглощения фермента при потенциалах раствора 900, 800, 750, 700, и 600 мВ соответственно. Вставка: Кривые титрования Нернста Lc1 и Lcв логарифмических координатах. (Б) Спектроэлектрохимические кривые титрования, показывающие зависимость поглощения растворов Lc при 614 нм (отражающее окислительно-восстановительное состояние меди Т1), относительно редокс-потенциала среды.

0.LACLАС1 0.LAC0.14 -0.0.-675 700 725 750 775 800 E / мВ (vs. NHE) 0.0.A 0.450 500 550 600 650 700 750, нм 0.LAC0.0.LAC0.0.0.Б 0.0.550 600 650 700 750 800 850 E/мВ (vs. NHE) Определены окислительно-восстановительные потенциалы (ОВП) Тмедного центра двух форм лакказ. На рисунке 3А представлены спектры log[(A/(A -A)] Поглощение, отн. ед.

Поглощение, отн. ед. (614 нм) поглощения, регистрируемые в процессе окислительно-восстановительного титрования Lc1 базидиомицета T. pubescens. Такие же изменения спектра наблюдались и в случае другой формы лакказы (Lc2). Восстановление Тмедного центра сопровождалось практически полным исчезновением поглощения в «голубой» области спектра. Кривые окислительновосстановительного титрования двух форм Lcs представлены на рисунке 3Б.

Показано, что ОВП Lc1 и Lc2 незначительно отличаются друг от друга и составляют 746 ± 5 и 730 ± 5 мВ, соответственно. Угол наклона кривых титрования составил 61 мВ и 65 мВ для Lс1 и Lс2, соответственно (Рисунок 3A, вставка), что соответствует одноэлектронному восстановлению ионов меди Т1 центра.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»