WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Никитина Оксана Викторовна ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ ЛИГНИНОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА TRAMETES PUBESCENS (SCHUMACH.) PILT Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель кандидат биологических наук, С. В. Шлеев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская кандидат технических наук Е. Н. Ефременко

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН Черноголовка, Московская обл.

Защита состоится 25 апреля 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее десятилетие большое число работ посвящено поиску и изучению новых штаммов базидиальных грибов – продуцентов лигнинолитических ферментов, а также поиску ферментов с новыми физико-химическими свойствами, что связано с широкими прикладными аспектами их использования. Внеклеточные ферментные системы дереворазрушающих грибов, как правило, включают спектр множественных форм оксидоредуктаз следующих трех основных структурных типов: гем-содержащие, флавинсодержащие и медьсодержащие ферменты.

Среди лигнинразрушающих грибов широко распространено явление образования множественных форм ферментов, однако его физиологическая роль до настоящего времени точно не установлена.

Лакказа (Lc) является одним из основных ферментов лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов. Однако, несмотря на большое число публикаций, касающихся фундаментальных исследований этого фермента, роль Lc в деградации лигнина до конца не ясна. Современные исследования базидиальных грибов в этой области показали, что Lc в сочетании с другими лигнинолитическими ферментами, марганецпероксидазой (MnP) или лигнинпероксидазой (LiP), может выполнять существенно более значимые функции при деградации лигнина, чем простое окисление его фенольных подструктур. В связи с этим интересно было исследовать возможные взаимосвязи, возникающие между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиальных грибов.

Известно, что наличие ионов металлов переменной валентности в древесине является необходимым условием для нормального функционирования грибных окислительно-восстановительных ферментов.

Особенно важным в этом отношении является наличие ионов марганца.

Именно Mn (II) является основным субстратом MnP, а также может играть значительную роль в каталитическом цикле LiP. Недавние исследования показали, что Mn (II) является также нетипичным субстратом Lcs базидиальных грибов и может обеспечивать наличие кооперативного действия Lc и MnP. В этой связи важным представляется выявление возможности протекания этих реакций с Lcs из других источников для установления роли этого фермента при функционировании лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов и изучение кооперативного действия Lc с другими лигнинолитическими ферментами. Кроме того, изучение согласованного действия основных ферментов лигнинолитического комплекса (Lc, LiP и MnP) в присутствии ионов марганца, как природного медиатора, может прояснить ферментативный и неферментативный механизмы деградации лигнина грибами белой гнили.

Базидиомицет Trametes pubescens является хорошим объектом исследования. Ранее было показано, что он может секретировать в культуральную жидкость несколько внеклеточных ферментов в детектируемых количествах, в частности: Lc, LiP и CDH. Известно также, что штамм 923-лекарственного базидиального гриба T. pubescens является промышленным штаммом-продуцентом биомассы, из которой получают биологически активные добавки. После отделения биомассы фильтрат культуральной жидкости не используют и потенциально он может служить источником внеклеточных ферментов.

Понимание роли отдельных ферментов, входящих в состав лигнинолитического комплекса при деградации лигнина, во-первых, открывает возможные пути оптимизации переработки этого полимера. Во-вторых, исследование множественных форм ферментов лигнинразрушающих грибов на примере базидиомицета Trametes pubescens представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения метаболизма грибов белой гнили, так и с позиции применения данного организма для получения препаратов, которые могут использоваться в различных областях биотехнологии.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств и закономерностей действия основных компонентов лигнинолитического комплекса базидиального гриба T. pubescens – Lc, LiP и MnP. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода очистки и получение гомогенных препаратов основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens: Lc, LiP и MnP.

2. Изучение основных физико-химических свойств выделенных ферментов.

3. Проведение сравнительных исследований множественных форм Lcs базидиомицета T. pubescens.

4. Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиального гриба T. pubescens при деградации модельных соединений лигнина. Установление роли каталитического окисления ионов Mn2+ до Mn3+ Lc в присутствии хелатирующих агентов.

5. Разработка вариантов возможного использования лигнинолитических ферментов базидиомицета T. pubescens для создания биосенсоров.

Научная новизна работы. Проведенные исследования позволили впервые изучить механизм кооперации Lc, LiP и MnP базидиального гриба Trametes pubescens в процессе деградации лигнина. Предложена схема кооперации ферментов лигнолитического комплекса данного базидиомицета.

Впервые очищены до гомогенного состояния и частично охарактеризованы LiP и MnP гриба T. pubescens. Проведено детальное сравнительное исследование двух новых, ранее не описанных множественных форм Lcs базидиомицета T.

pubescens. Электрохимическим методом доказана возможность окисления ионов Mn2+ до Mn3+ высокопотенциальными Lcs базидиальных грибов в присутствии хелатирующих агентов и определены основные параметры данной реакции.

Практическая ценность работы. Результаты исследования некоторых физико-химических свойств Lc, ее субстратной специфичности и механизма действия фермента вносят вклад в понимание механизма катализа многоядерными медьсодержащими оксидоредуктазами. На основе частично очищенного препарата Lcs базидиомицета T. pubescens разработан амперометрический биосенсор для определения соединений фенольной структуры.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на научных конференциях: 8-ой Международной Пущинской Школе-Конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005), International Conference Fundamentals & Applications “Biocatalysis – 2005” (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано печатных работ, в числе которых 3 статьи в российских и зарубежных научных журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 129 страницах. Список цитируемой литературы включает наименований. Иллюстративный материал содержит 29 рисунков и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный внеклеточным ферментативным системам базидиальных грибов. Рассматриваются строение, свойства и механизмы действия основных ферментов, входящих в состав лигнинолитического комплекса базидиомицетов. В последнем разделе собраны факты, описывающие ферментативные системы базидиальных грибов рода Trametes.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Объекты исследования. В качестве объектов исследования использовали внеклеточные ферменты: Lc, LiP и MnP – лигнинолитического комплекса штамма базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach.) Pilt (Syn.:

Coriolus pubescens (Schum. ex Fr.) Qul.) ВСБ 923-2 семейства Polyporaceae.

Культивирование базидиомицета T. pubescens. Получение культуральной жидкости с высоким содержанием Lc и LiP-активности проводили путем глубинного культивирования штамма-продуцента в литровом ферментационном аппарате “Marubishi” (Япония) при избыточном давлении 0,4 атм. Аэрация воздухом в стерильных условиях составляла 1 л/1л в мин с механическим перемешиванием 250 об/мин мешалкой турбинного типа на среде следующего состава, г/л: глюкоза – 20,0; (NH4)2SO4 – 2,5; KH2PO4 – 1,2; мочевина – 0,7; кукурузный экстракт сгущенный – 10; вода водопроводная.

Культивирование осуществляли в условиях рН-статирования при рН 3,5 и температуре +26оС. Продолжительность культивирования составила 114 часов.

Получение культуральной жидкости с высоким содержанием Lc и MnPактивности проводили путем глубинного культивирования того же штамма гриба в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл, с объемом среды 150 мл на круговой качалке (200 об/мин) при температуре +26°С и исходном рН-среды 5,8 на среде следующего состава, г/л: меласса – 30; NH4NO3 – 3; KH2PO4 – 1,2;

мочевина – 0,7. Продолжительность культивирования составила 72 часа.

Выделение и очистка ферментов. Все виды колоночной хроматографии низкого давления проводили с помощью комплекта стандартного оборудования для жидкостной хроматографии низкого давления фирмы “Pharmacia LKB Biotechnology” (Швеция) при температуре +4°С. Жидкостную хроматографию среднего и высокого давления проводили с использованием системы ЖХВД “Стайер” фирмы “Аквилон” (Россия) при комнатной температуре.

Контроль активности ферментов. Контроль активности ферментов в процессе выделения и очистки осуществляли спектрофотометрическими методами. Активность ферментов выражали в международных единицах – единица активности соответствовала такому количеству фермента, которое катализировало превращение 1 мкмоля субстрата или образование 1 мкмоля продукта за 1 минуту. Активность Lc регистрировали, используя в качестве субстрата 10 мМ раствор пирокатехина ( = 410 нм; = 740 M-1 см-1) в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 4,5. Контроль активности LiP осуществляли по окислению вератрового спирта, измеряя изменение оптического поглощения при 310 нм ( = 9300 M-1 см-1) в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 3,0.

Активность MnP регистрировали, используя в качестве субстрата MnSO4 при 238 нм ( = 6500 M-1 см-1) в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 5,0, в присутствии 0,1 мМ Н2О2.

Кинетические измерения и рН-зависимость. Кинетические измерения при определении каталитических параметров ферментативных реакций Lc для пирокатехина, гидрохинона, гваякола и K4Fe(CN)6, а также измерение рНзависимости Lcs проводили на кислородном электроде типа Кларка по изменению концентрации O2 в системе. Определение кинетических параметров и измерение рН-зависимости реакции окисления АБТС осуществляли в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 4,5, при длине волны 436 нм.

Регистрацию окисления ионов Mn2+ до Mn3+, катализируемое Lc, осуществляли в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 5,0 ( = 238 нм) и в 0,1 М Naоксалатном буфере, рН 5,0 ( = 270 нм) в присутствии 0,1 мМ MnSO4.

Образование H2O2 в системе, содержащей Lc, ионы Mn2+ и хелатор, регистрировали с помощью LiP по окислению АБТС. Реакционную смесь, содержащую 2.10-7 М Lc и 0,1 мМ МnSO4 в 0,1 М Na-тартратном или Naоксалатном буфере, рН 5,0, инкубировали в течение 120 мин при комнатной температуре, затем подвергали ультрафильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 12 кДа путем центрифугирования в течение 30 мин при об/мин для удаления Lc. Концентрацию Н2О2 определяли по увеличению оптической плотности в реакции окисления АБТС, катализируемой LiP.

Возможное образование супероксиданион-радикала регистрировали по восстановлению нитросинего тетразолия (0,2 мМ) при 560 нм.

Спектральные исследования. Все спектры записывали в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,5. Спектры оптического поглощения регистрировали на спектрофотометре Coulter DU 650 “Beckman” (Германия); спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции записывали с помощью спектрофлуофотометра RF-5301 PC “Shimadzu” (Япония). Регистрацию спектров ЭПР осуществляли на ЭПР-спектрометре ESC-106 фирмы “Bruker” (Германия). Спектры кругового дихроизма регистрировали на спектрофотометре Jasco J-715 (Япония). Параметры вторичной структуры белков рассчитывали с использованием компьютерной программы «ProteinCD», версия 1,5 (Москва, Россия).

Масс-спектроскопические исследования проводили с использованием лазер десорбционно-ионизирующей (MALDI) масс-спектрометрии на массспектрометрическом анализаторе “Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer” MALDI time-of-flight (TOF) (США). Гидролизаты белков также анализировали с использованием четырех полюсной ионной ловушки Bruker Esquire (Германия) в сочетании с нанораспылителем для их ионизации (ESIQIT-MS анализ).

Электрохимические исследования.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»