WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

PPA PPA-Na 1-фенил-2,3-диметил- 1-фенил-3-метил-4-метиламинопиразолон-5-N(4)-метансульфонат натрия 4-аминопиразолон-O NHC N OH HO C C O HO O HPI HABA N-гидроксифталеимид 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота Исследование зависимостей начальной скорости гомогенных ферментативных реакций от концентрации исследуемых соединений показало, что кинетика реакций описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Для оценки эффективности взаимодействия лакказы с этими соединениями было проведено сравнение с одним из субстратов лакказ – гидрохиноном. Результаты представлены в Таблице 4.

Как видно из таблицы, производные фенилметилпиразолона с сульфогруппой в фенильном кольце (pSPP и mSPP), либо аминогруппой в гетероцикле (PPA), являются субстратами, сравнимыми по своим каталитическим константам с гидрохиноном. Эффективность процесса ферментативного окисления РР намного ниже, что, возможно, связано с его гидрофобностью.

Введение в гетероцикл фенилметилпиразолона электрон-донорных групп (аминогруппы в положение 4 и метильной группы в положение 2) увеличивает значение kкаж/Kм в случае PPA более чем в 18 раз. Однако, это значение в несколько раз меньше, чем для сульфо-производных фенилметилпиразолона. В случае PPA-Na, введение заместителей (метильной и метан-сульфоновой групп) в аминогруппу мало отражается на скорости ферментативной реакции, но значение Км увеличива ется более чем в 10 раз. Возможно, более слабое взаимодействие лакказы с PPA-Na объясняется проявлением стерического фактора.

Таблица 4. Кинетические и электрохимические параметры субстратов лакказ Соединение kкаж,**с-1 Kм, мМ (kкаж/ Kм)·10-4, М-1с-1 E1/2, мВ I/Iдиф*** HQ 52.0 0.3 17.3 -20 --PP* 9.7 2.1 0.46 430 0,mSPP 51.5 0.22 23.4 660 1,pSPP 43.9 0.29 15.0 570 0,PPA 35.1 0.41 8.66 0,PPA-Na 36.5 5.0 0.73 --- HPI* 3.6 6.0 0.06 870 2,HABA 43.4 0.28 15.5 390 --E1/2 – потенциал полуволны окисления субстрата (скорость развертки потенциала 5 мВ/с);

Iдиф – анодный ток окисления медиатора;

I – прирост анодного тока при окислении медиатора (0.2 мМ) в присутствии VA (2 мМ).

Примечания:

Рабочие растворы содержали 2% этилового спирта ** kкаж определяли по уменьшению концентрации кислорода без учета стехиометрии реакции *** Определение I и Iдиф проводили при потенциале 1000 мВ Взаимодействие лакказы с HPI характеризуется низким сродством этого субстрата к ферменту и низкой скоростью реакции, а HABA является субстратом лакказы, сравнимым по своим кинетическим параметрам с гидрохиноном.

Электрохимические исследования промежуточных соединений, образующихся при окислении медиаторов Были проведены вольтамперометрические исследования отобранных соединений. В качестве примера на Рис. 10 представлены циклические вольтамперограммы, записанные в растворах mSPP и HPI.

mSPP HPI Рисунок 10. Циклические вольтамперные кривые mSPP и HPI -Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0;

--концентрация медиаторов 0.2мМ;

-скорость развертки потенциала -5 мВ/с (1), 25 мВ/с (2), -16 -100 мВ/с (3), 200 мВ/с (4).

0 200 400 600 800 1000 1200 0 200 400 600 800 1000 Е, мВ (отн. Ag/AgCl) Ток, мкА На вольтамперных кривых фенилметилпиразолона и его производных наблюдались ярко выраженные токи окисления этих соединений в области потенциалов 450-660 мВ. Для PP, РРА и рSPP реакции окисления были необратимы, что подтверждалось отсутствием реакции электровосстановления на катодной ветви циклических вольтамперограмм. На вольтамперных кривых, записанных в растворах mSPP (Рис. 10) и PPA-Na, проявлялись незначительные катодные токи, которые были в 4-6 раз меньше анодных. По-видимому, необратимость электродных реакций для фенилметилпиразолона и его производных связана с неустойчивостью продуктов окисления и включением их в химические реакции до того, как они успевали восстановиться на электроде.

В отличие от производных фенилметилпиразолона, при высоких скоростях развертки потенциала система с HPI была квази-обратимой, что подтверждалось наличием на вольтамперограммах катодного пика (Рис.10). Потенциал средней точки между катодным и анодным пиками равен 870 мВ и его условно можно принять за редокс потенциал этой пары. По-видимому, при низких скоростях развертки потенциала продукт, образующийся при окислении, был недостаточно стабилен и не успевал восстановиться на электроде. Таким промежуточным продуктом может быть >NO• радикал, как это было показано для таких медиаторов лакказ как HBT, TEMPO [Fabbrini et al., 2002; Cantarella et al., 2003].

Образование описанных выше интермедиатов исследуемых соединений происходило за счет их неферментативного окисления на электродах. Зависимость максимального анодного тока от квадратного корня из скорости развертки потенциала имела линейный характер, что свидетельствовало о том, что для всех исследованных соединений электродный процесс протекал в диффузионно-контролируемом режиме.

Потенциалы полувысоты анодного пика для всех изученных производных фенилметилпиразолона, а также для HPI и HABA, представлены в Таблице 4. Как и следовало ожидать, потенциал полувысоты анодного пика зависел от природы заместителя в структуре фенилметилпиразолона. Он увеличивался при введении электрон-акцепторной сульфогруппы в фенильное кольцо (mSPP и pSPP) и уменьшался при введении в гетероцикл электрон-донорной аминогруппы (РРА).

Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при ферментативном окислении усилителей действия лакказ Были проведены дополнительные спектральные исследования продуктов гомогенного окисления двух соединений класса фенилметилпиразолонов – PPA-Na и mSPP в присутствии лакказы T. hirsuta.

В случае PPA-Na спектры поглощения интермедиатов, образующихся в результате ферментативного окисления, зависели от соотношения концентраций медиатора и фермента в растворе (Рис. 11), что указывало на возможное образование нескольких промежуточных продуктов окисления медиатора.

0.PPA-Na – 10-3 M Лакказа – 10-7 М 0.6 0.4 Рисунок 11. Изменение во времени спектров поглощения продуктов 0.1 реакции, образующихся в процессе ферментативного окисления PPA-Na, 300 350 400 450 с участием лакказы T. hirsuta при 1.различных концентрациях медиатора PPA-Na – 10-3 M Лакказа – 2•10-6 М и фермента 0.1- исходный спектр; 2 - 1 мин;

0.3 - 10 мин; 4 - 30 мин; 5 - 60 мин.

0.3 Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0.

350 450 550 650 750, нм Основываясь на электрохимических данных по гетерогенному окислению PPA-Na, можно предположить существование как минимум трех основных промежуточных продуктов ферментативного окисления данного субстрата (с потенциалами максимумов анодных пиков 290, 570, и 770 мВ).

При ферментативном окислении mSPP образовывалось, по-видимому, два интермедиата (Рис. 12). При этом продукт с полосой поглощения при 340 нм являлся более высоко редокспотенциальным, так как его формирование протекало на более поздней стадии ферментативной реакции. Можно предположить образование двух основных интермедиатов mSPP со значениями потенциалов 660 и 850 мВ, соответствующими максимумам поглощения при 270 и 340 нм, соответственно. При этом образование первого продукта являлось быстрым процессом, в то время как образование второго продукта – процесс более медленный. Похожее двухступенчатое поведение при ферментативном окислении было показано для Оптическая плотность ABTS, что позволяет предположить сходство механизмов ферментативного окисления обоих субстратов лакказы [Bourbonnais & Paice, 1990; Sols-Oba et al., 2005].

Рисунок 12. Изменение во времени спектров поглощения продуктов mSPP – 10-4 M 0.реакции, образующихся в процессе Лакказа – 10-6 М ферментативного окисления mSPP с 0.2 участием лакказы T. hirsuta:

0.1 – исходный спектр;

0.2 – 10 мин; 3 – 30 мин.

Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, 230 280 330 380 рН 5.0.

, нм Электрохимическое окисление вератрового спирта в присутствии медиаторов Методом циклической вольтамперометрии было изучено взаимодействие отобранных соединений с модельным соединением лигнина – вератровым спиртом (VA). Этот метод позволяет исследовать не только электродные процессы, но и сопряженные с ними химические реакции.

В качестве примера на Рис. 13 представлены циклические вольтамперограммы, записанные в растворах вератрового спирта, медиаторов (mSPP, PPA-Na, HPI), а также смеси VA-медиатор. Необходимо отметить, что до потенциала 1000 мВ вератровый спирт электрохимически не активен.

mSPP PPA-Na 0 1 ----2 -2 ----12 ---6 -18 -200 500 800 1100 200 500 800 1100 250 550 850 Е, мВ (отн. Ag/AgCl) Рисунок 13. Циклические вольтамперные кривые, записанные в растворах (1) медиатора (0.2 мМ); (2) вератрового спирта (2 мМ) и (3) смеси медиатора и вератрового спирта в тех же концентрациях Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0; скорость развертки потенциала 5 мВ/с В присутствии mSPP (Рис. 13), а также pSPP и РРА, окисление вератрового спирта происходило с меньшим перенапряжением, чем при прямой электродной Оптическая плотность Ток, мкА реакции. На анодной ветви кривой наблюдалось увеличение тока окисления в области потенциала 1000 мВ. В то же время, добавление к раствору PPA-Na вератрового спирта не приводило к увеличению токов окисления (Рис. 13).

В присутствии вератрового спирта в растворах гидроксифталеимида наблюдалось значительное увеличение анодного тока в области потенциалов окисления HPI и полное исчезновение тока восстановления на катодной ветви кривой (Рис.

13). Отсутствие катодного тока можно объяснить включением интермедиата электродного окисления HPI в процесс химического окисления вератрового спирта вблизи поверхности электрода. Химически восстановленный интермедиат вновь окислялся на электроде, давая увеличение анодного тока. При потенциале 910 мВ и скорости развертки потенциала 5 мВ/с анодный ток в присутствии вератрового спирта увеличивался в 2.5 раза по сравнению с током в отсутствии VA (Рис. 13), что указывало на регенерацию восстановленной формы медиатора в результате каталитического окисления вератрового спирта и на повторное окисление HPI на электроде.

До потенциала 1000 мВ не наблюдалось ускорения электроокисления вератрового спирта в присутствии низкопотенциального продукта электродного окисления HABA, редокс потенциал которого равен 390 мВ.

В Таблице 4 представлены соотношения прироста анодного тока в растворе, содержащем вератровый спирт и медиатор, к диффузионному току окисления самого медиатора при потенциале 1000 мВ. Как видно из таблицы, эффективность электрокаталитического окисления вератрового спирта возрастала с увеличением потенциала полуволны окисления усилителя. При взаимодействии с вератровым спиртом эффективными являлись соединения, имеющие потенциал полувысоты волны окисления выше 500 мВ.

Окисление вератрового спирта в системе лакказа/редокс-усилитель фермента Для выяснения эффективности исследуемых медиаторов при деградации модельного соединения лигнина – вератрового спирта, были проведены прямые эксперименты по окислению VA в гомогенном растворе системой лакказа/медиатор.

Продукты окисления разделяли методом ВЭЖХ. Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени их удерживания на колонке. В качестве маркеров использовали вератровый спирт, вератровый альдегид и вератровую кислоту, количество которых в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы “Мультихром” (Россия). Для оценки эффективности аналогичный эксперимент проводили с использованием ABTS в качестве медиатора. Количественные результаты экспериментов по окислению вератрового спирта в системе лакказа/медиатор представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Окисление вератрового спирта системами лакказа/медиатор Степень конверсии VA после Состав реакционной смеси 48 часов инкубации, (%) mSPP + лакказа + VA 35,pSPP + лакказа + VA 30,PPA-Na + лакказа + VA 3,HPI + лакказа + VA 73,ABTS + лакказа + VA 75,mSPP + VA 3,pSPP + VA 3,PPA-Na + VA 0,HPI + VA 1,ABTS + VA 1,Лакказа + VA 1,Примечание: значения были рассчитаны как среднее по трем измерениям При использовании системы лакказа/HPI была достигнута высокая степень превращения вератрового спирта, сравнимая со степенью окисления VA в присутствии ABTS. Взаимодействие лакказы с гидроксифталеимидом характеризуется низкой скоростью реакции (Табл. 4). Однако, как показали электрохимические исследования, образующийся при окислении катион-радикал способен с довольно высокой скоростью окислять вератровый спирт. Благодаря этому общая эффективность процесса деградации вератрового спирта системой лакказа/HPI высока и составляет 70% превращения VA за 48 часов реакции.

Иначе обстоит дело с системами лакказа/производные фенилметилпиразолона.

Как показали кинетические исследования (Табл. 4), лакказа с высокой скоростью катализирует окисление сульфопроизводных данного класса. Электрохимическими экспериментами было показано, что продукты окисления этих соединений нестабильны. Однако потенциал и время жизни продуктов окисления оказываются достаточными для того, чтобы окислить вератровый спирт. Благодаря высокой скорости ферментативного окисления этих производных общая эффективность окисления VA системой лакказа/pSPP или mSPP достаточно высока, в результате чего процент превращения спирта достигает, соответственно, 30 и 35% за 48 часов реакции. Более низкий по сравнению с ABTS процент деградации спирта объясняется, по-видимому, слабой обратимостью процесса окисления этих производных фенилметилпиразолона.

Как и следовало ожидать на основании электрохимических исследований, в системе лакказа/PPA-Na скорость окисления вератрового спирта оказалась значительно ниже, чем при использовании сульфопроизводных фенилметилпиразолона. В то же время, при использовании PPA-Na окисление вератрового спирта идет до соответствующей кислоты, в то время как большинство известных к настоящему времени медиаторов окисляют вератровый спирт до альдегида [Bourbonnais, Paice, 1990]. По-видимому, несмотря на низкую скорость реакции окисления вератрового спирта, высокопотенциальные интермедиаты PPA-Na, образующиеся в присутствии лакказы, способны к дальнейшему окислению вератрового альдегида до вератровой кислоты. Это хорошо согласуется с электрохимическими и спектральными результатами, полученными для PPA-Na.

Контрольные эксперименты показали, что в отсутствии лакказы исследуемые нами медиаторы практически не способны к окислению вератрового спирта, а лакказа в отсутствии медиаторов окисляет менее 2% VA.

Таким образом, производные 1-фенил-3-метил-пиразолона-5 могут использоваться в качестве усилителей действия лакказы.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»