WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Спектры ЭПР, характеризующие ионы меди Т1 и Т2 центров изученных лакказ, имели сходные характеристики (Рис. 3).

, V мМ О /( мин·мг) 1.6 0.1 1.Рисунок 2. Спектры оптического 1.2 поглощения лакказ 1 – T. hirsuta, 0.2 – T. ochracea, 0.8 3 – C. maxima, 4 – C. fulvocinerea.

0.Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 6.0);

500 550 600 650 700 750 800 0.длина светового пути 1 см; скорость 4 сканирования 120 нм/мин; t = 20°С;

0.концентрация ферментов ~ 1 мг/мл 250 350 450 550 650 750, нм T1 Cu Рисунок 3. ЭПР-спектры лакказ 20 мT 1 – T. hirsuta, 2 – T. ochracea, 3 – C. maxima, 4 – C. fulvocinerea.

Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 6.0);

температура 77оК; Х-диапазон, микроволновая мощность 20 мВ; амплитуда модуляции 0.5 мТ;

концентрация ферментов ~ 1 мг/мл.

T2 Cu На Рис. 4 представлены спектры возбуждения (I) и излучения (II) флуоресценции исследованных лакказ, записанные при комнатной температуре. Возбуждение в области биядерного медного центра (330 нм) приводит к эмиссии при 432, 438, 436 и 443 нм для лакказ T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima, соответственно. Необходимо отметить, что эти спектры не сильно различаются между собой и хорошо согласуются с литературными данными [Shin et al., 2000].

I II 4 Рисунок 4. Спектры возбуждения (I) и 2 излучения флуоресценции (II) лакказ 1 – T. hirsuta, 2 2 – T. ochracea, 3 – C. maxima, 4 – C. fulvocinerea.

Условия: 0.1 М фосфатный буфер (рН 6.0);

t = 20°С;

концентрация ферментов ~ 1 мг/мл;

300 350 400 450, нм Поглощение, о.е.

Интенсивность флуоресценции Спектральные характеристики Т1, Т2 и Т3 центров лакказ, полученные на основании данных спектрофотометрии, ЭПР-спектроскопии и флуоресценции представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Спектральные характеристики Т1, Т2 и Т3 центров лакказ T1 T2 T(спектрофотометрия и ЭПР) (ЭПР) (флуоресценция) Максимум Максимум Максимум g|| A|| g|| A|| поглощения испускания возбуждения (10-4 см-1) (10-4 см-1) (нм) (нм) (нм) T. hirsuta 607 2.19 95 2.26 186 418 T.ochracea 608 2.20 94 2.24 194 422 C. maxima 607 2.18 94 2.24 193 425 C. fulvocinerea 607 2.18 94 2.23 210 418 В результате проведенных исследований были определены основные физикохимические характеристики ферментов и спектральные характеристики ионов меди, входящих в состав активного центра лакказ, выделенных из культуральных фильтратов базидиальных грибов T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima. Показано сходство биохимических и спектральных параметров исследованных ферментов.

Определение потенциала Т1 центра лакказ.

Одной из основных характеристик лакказ является стандартный окислительновосстановительный потенциал Т1 центра ферментов. Значения этого потенциала варьируются у различных лакказ от 430 до 790 мВ отн. НВЭ [Solomon et al., 1996;

Shleev et al., 2005b]. T1 центр фермента является первичным акцептором электронов, поступающих от субстратов-восстановителей. Непосредственно лакказы окисляют только те соединения, окислительно-восстановительный потенциал которых не превышает или превышает незначительно редокс-потенциал иона меди Т1 центра фермента [Xu, 1997]. Кроме того, от редокс-потенциала Т1 центра зависит эффективность катализа для большинства субстратов лакказ, что делает лакказы с высокими потенциалами Т1 центра весьма перспективными объектами для биотехнологических целей, например, для обесцвечивания бумажной пульпы, биоремедиации и деградации различных ксенобиотиков. Определение редокс потенциалов ионов меди первого типа лакказ было необходимо для выявления наиболее высокопотенциальных ферментов, которые, участвуя в реакциях окисления субстратов, приводят к образованию высокопотенциальных интермедиатов, что весьма важно при проведении биотехнологических процессов.

В качестве примера на Рис. 5 представлены спектры поглощения растворов лакказы T. hirsuta, записанные в процессе окислительно-восстановительного титрования. Аналогичные данные были получены при окислительновосстановительном титровании лакказ T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima.

Восстановление Т1 медного центра сопровождалось уменьшением пика поглощения в области 610 нм.

1.0.1.Рисунок 5. Спектры 2 0.потенциометрического титрования 0.0.в анаэробных условиях Т1 центра -0.лакказы T. hirsuta.

-1.760 780 800 820 840 860 Вставка: Кривая титрования в 0.E, mV полулогарифмических координатах.

A0 и A – поглощение при 610 нм растворов окисленной и частично 0.восстановленной лакказы.

Условия: 0.1 М фосфатный буфер, рН 6.0;

1- фермент (7 мкМ) и 2 мМ K3Mo(CN)8;

0.2-6 - добавление к исходному раствору K4Mo(CN)8 до конечной концентрации 2 мМ.

0.500 600 700, нм Основные электрохимические характеристики Т1 центров изученных лаккказ представлены в Таблице 4. Как видно из таблицы, тангенс угла наклона прямой титрования составляет 49, 56 и 57 мВ для лакказ T. hirsuta, C. maxima и C. fulvocinerea, соответственно, что позволяет предположить факт одноступенчатого, одноэлектронного процесса восстановления иона меди первого типа. Это хорошо согласуется с литературными данными, полученными для лакказ из других источников.

Таблица 4. Электрохимические характеристики Т1 центра лакказ Потенциал Т1 центра, Тангенс угла наклона Лакказа мВ кривой титрования, мВ T. ochracea 790 ± 10 32 ± T. hirsuta 780 ± 10 49 ± C. maxima 750 ± 5 56 ± C. fulvocinerea 780 ± 10 57 ± Примечание: потенциалы приведены относительно нормального водородного электрода lg[(A/(A -A)] Поглощение, опт. ед.

В то же время тангенс угла наклона прямой титрования лакказы T. ochracea составляет 32 мВ, что формально указывает на возможность протекания двухэлектронного процесса восстановления фермента. Однако, даже в случае одноэлектронного редокс-процесса, уменьшение угла наклона линейного участка кривой титрования может быть связано с наличием в процессе реакции стадии, не относящейся непосредственно к восстановлению иона меди.

Таким образом, все изученные лакказы относятся к высокопотенциальным ферментам и благодаря высокому редокс потенциалу Т1 центра являются высокоактивными в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров. Электрохимические исследования лакказ представляют интерес для понимания механизма катализа и возможности использования этих ферментов в гетерогенных биоэлектрокаталитических системах.

Биоэлектрокаталитические свойства лакказ Методами циклической вольтамперометрии исследованы прямые (безмедиаторные) электрохимические реакции восстановления дикислорода с участием лакказ T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima, адсорбированных на электродах из спектрального графита. В аэробных условиях для всех исследованных лакказ показана возможность прямого электронного переноса с электрода на фермент с последующим восстановлением молекулярного кислорода. На Рис. 6 представлены циклические вольтамперограммы немодифицированных и модифицированных лакказами электродов из спектрального графита в насыщенных кислородом буферных растворах.

При адсорбции на электродах все лакказы сильно уменьшали перенапряжение реакции электровосстановления молекулярного кислорода до воды. Необходимо отметить, что для лакказы C. fulvocinerea наблюдалась более низкая электрокаталитическая активность по сравнению с другими изученными ферментами, в то время как ее активность в гомогенном растворе (Табл. 2) сравнима с активностью других лакказ. Возможно, это объясняется высоким (32%) содержанием углеводов в лакказе C. fulvocinerea, что может оказывать влияние на ориентацию молекул фермента на поверхности электрода, а также затруднять перенос электрона с электрода на Т1 центр фермента.

Как видно из Рис. 6, начало электровосстановления дикислорода на электродах, модифицированных лакказами, находится в области 800 мВ, то есть существует корреляция между потенциалом Т1 центра ферментов (Табл. 4) и началом ре акции электровосстановления дикислорода на электроде. Таким образом, все изученные в работе лакказы могут быть использованы в качестве катализаторов для создания катода биотопливного элемента.

15 T. ochreacea T. hirsuta 10 5 0 Рисунок 6.

--Электровосстановление -10 -молекулярного кислорода --на немодифицированных (1) --и модифицированных (2) ---50 150 350 550 750 950 1150 -50 150 350 550 750 950 лакказами электродах из Е, мВ (отн.НВЭ) Е, мВ (отн.НВЭ) спектрального графита.

C. fulvocinerea C. maxima Условия: насыщенный кислородом 50 мМ цитратно1 фосфатный буфер (рН 3.0);

--скорость развертки потенциала –.

-10 -10 мВ/с;

--стартовый потенциал – 1100 мВ -----50 150 350 550 750 950 -50 150 350 550 750 950 Е, мВ (отн.НВЭ) Е, мВ (отн.НВЭ) Принципы отбора медиаторов лакказ Первоначально медиаторами называли соединения – субстраты фермента, в результате окисления которых образовывались устойчивые высокопотенциальные продукты, способные вступать в химические неферментативные реакции с другими соединениями. При этом окисленный медиатор восстанавливался до первоначальной формы и таким образом формировался замкнутый цикл. Простейшая схема функционирования лакказа-медиаторных систем представлена на Рис. 7.

О лакказа медиатор субстрат 2 ок Рисунок 7. Принцип функционирования ЛМС Н О лакказа медиатор субстраток 2 ок Оптимальный редокс-медиатор должен быть хорошим субстратом лакказы, его окисленная и восстановленная формы должны быть стабильны и не должны ингибировать ферментативную реакцию или инактивировать фермент, а процесс его редокс-превращения должен быть циклическим. Соединения, которые в литературе называют медиаторами лакказ, на самом деле ими вообще не являются или их можно отнести к медиаторам с большой натяжкой. В первую очередь это связано Ток, мкА Ток, мкА Ток, мкА Ток, мкА с низкой стабильностью образующихся интермедиатов и, как следствие, низким числом редокс-циклов. В связи с этим в литературе появился термин «enhancer», то есть усилитель действия фермента.

Принимая во внимание требования к редокс-медиаторам, была предложена схема отбора и экспериментальных методов тестирования органических соединений – потенциальных медиаторов лакказ, включающая 4 стадии:

1. Отбор соединений на основе анализа структурной формулы с учетом необходимости наличия сопряженных связей и гетероциклических атомов, а также –OH и –NH2 групп.

2. Определение каталитических характеристик отобранных соединений в гомогенных ферментативных реакциях, катализируемых лакказой.

3. Анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствии и в присутствии модельных соединений лигнина.

4. Прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения лигнина системой медиатор/лакказа.

Первичный отбор соединений на основе их структурных формул Реакционная способность ароматических и гетероциклических соединений часто зависит от природы и положения заместителей. Влияние заместителей на окисление этих соединений определяется как электронными эффектами, так и стерическими факторами. Наша задача состояла в том, чтобы выбрать соединения для использования в ЛМС с наилучшими каталитическими параметрами в гомогенной ферментативной реакции и оптимальными характеристиками электрохимической реакции на электроде (значение редокс потенциала, обратимость реакции). При первичном отборе усилителей необходимо учитывать, что введение в структуру соединения тех или иных заместителей должно приводить к увеличению стабильности образующихся в результате реакции радикалов. Окисление соединений, в структуре которых присутствует гидроксильная группа, приводит к образованию нестабильных фенокси-радикалов, способных к реакции конденсации, а наличие аминогруппы вызывает димеризацию/полимеризацию промежуточных форм соединения. Электрон-донорные заместители (алкильная, фенильная и аминогруппы), увеличивая скорость окисления соединения и обеспечивая при этом стабильность образующихся радикалов, уменьшают окислительно-восстановительный потенциал соединения. Электрон-акцепторные группы (например, карбоксильная или сульфо- группы), увеличивают окислительно-восстановительный потенциал соединения [Xu et al., 2001] и улучшают его растворимость в водных растворах.

При отборе соединений в качестве усилителей действия лакказ необходимо принимать во внимание, что их редокс-потенциал должен быть выше 450 мВ [Bourbonnais et al., 2000], в противном случае они не могут принимать участие в окислении нефенольных подструктур лигнина.

В силу возможного масштабного коммерческого использования медиаторов, эти соединения должны быть доступны и иметь при этом низкую стоимость. Поиск нетоксичных гетероциклических соединений показал, что одним из наиболее перспективных классов органических соединений, которые могли бы использоваться в качестве медиаторов лакказ, являются соединения с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые производятся в промышленных масштабах и имеют низкую себестоимость. Одним из наиболее известных соединений данного класса является метамизол натрия или анальгин (PPA-Na), который используется в медицинской практике в качестве обезболивающего средства.

1-Фенил-3-метил-пиразолоны-5 (в дальнейшем именуемые фенилметилпиразолоны) относятся к гетероциклическим соединениям, содержащим в своем составе два заместителя электрон-донорной природы – метильную и фенильную группы, и присутствуют в растворе в виде двух таутомерных форм (Рис. 8).

H3C H3C C CH2 C CH N C N C Рисунок 8. Таутомерные превращения O OH N N фенилметилпиразолонов Субстратная специфичность Было исследовано около двадцати соединений различной структуры, в том числе гетероциклических, >N-OH соединений и производных бензойной кислоты.

Исследования гомогенных реакций с участием лакказы T. hirsuta позволили отобрать соединения, которые могут являться усилителями действия фермента. Среди этих соединений выраженные субстратные свойства по отношению к лакказе обнаружены у 1-фенил-3-метилпиразолона-5 (РР), его сульфо- (mSPP и pSPP) и аминопроизводных (PPA и PPA-Na), а также у N-гидроксифталеимида (HPI) и 3-амино-(6-гидрокси)-бензойной кислоты (HABA). Структурные формулы этих соединений представлены на Рис. 9.

H3C H3C H3C N N N OH N OH OH N N SO3H SO3H mSPP pSPP РР 1-(3’-сульфофенил)- 1-фенил-3- 1-(4’-сульфофенил)- 3-метил-пиразолон-метилпиразолон-5 3-метил-пиразолон-CHРисунок 9.

NHH3C H3C N CH2SO3Na Структурные N N формулы N O OH N H3C органических веществ – потенциальных медиаторов лакказ.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»