WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Морозова Ольга Владимировна ЛАККАЗЫ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ, ЛАККАЗА-МЕДИАТОРНЫЕ СИСТЕМЫ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель доктор химических наук, профессор А.И.Ярополов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская доктор химических наук И.Н.Курочкин

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН Черноголовка, Московская обл.

Защита состоится «5» декабря 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « 2 » ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В связи с ужесточением требований к экологической безопасности химических процессов все большие масштабы приобретает использование биокаталитических технологий в промышленности. Промышленное получение биокатализаторов на основе технических ферментов является экономически выгодным. Об этом свидетельствует возрастающий объем продаж технических препаратов ферментов на мировом рынке, который в 2004 году составил почти 1,5 миллиарда долларов.

В промышленных биокаталитических процессах широко используются различные ферменты. Особый интерес представляет лакказа, которая способна катализировать реакции окисления широкого круга органических веществ молекулярным кислородом. Каталитические и электрокаталитические свойства лакказы дают возможность ее широкого использования в целлюлозно-бумажной промышленности для делигнификации бумажной пульпы, в текстильной промышленности для отбеливания тканей, для детоксикации и обесцвечивания сточных вод, для биодеградации ксенобиотиков, для создания антимикробных композиций, в пищевой и косметической промышленности, при получении древесноволокнистых плит без применения токсичных связующих, при производстве моющих средств, при разработке катодов биотопливных элементов и других областях [Durn et al., 2002;

Mayer & Staples, 2002; Cuoto & Herrera, 2006]. Так, например, фирма «Novozymes» (Дания) выпускает на основе лакказы коммерческие препараты для отбеливания и обработки текстильных изделий, делигнификации бумажной пульпы и обработки корковой пробки [http://www.novozymes.com].

Помимо использования лакказ в различных биотехнологических процессах этот фермент представляет большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований его структуры и механизма катализа. Это обусловлено строением активного центра лакказ, в который входят четыре иона меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в процессе ферментативного окисления субстратов позволяет осуществлять восстановление молекулярного кислорода до воды, минуя стадию образования пероксида водорода.

Интерес к практическому использованию лакказ возрос после открытия соединений «усиливающих» действия фермента, так называемых медиаторов [Bourbonnais, Paice, 1990]. Это позволило существенно расширить область их практического применения. Таким образом, создание высокоэффективных лакка за-медиаторных систем (ЛМС) для использования в биотехнологии является в настоящее время весьма актуальным.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в сравнении свойств лакказ, выделенных из различных базидиальных грибов, для установления сходства и различий их физико-химических характеристик, а также поиск редокс-медиаторов этих ферментов с целью создания эффективных ЛМС. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести в одинаковых условиях сравнение основных физико-химических характеристик лакказ базидиальных грибов Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima с целью выявления наиболее стабильного, высокопотенциального и каталитически активного фермента 3. Разработать схему отбора потенциальных редокс-медиаторов лакказ 4. Найти соединения, которые наиболее полно отвечали бы требованиям, предъявляемым в настоящее время к медиаторам лакказ 5. Провести апробацию лакказа-медиаторных систем на примере делигнификации лигноцеллюлозы.

Научная новизна работы. Проведенные исследования позволили впервые сравнить в одинаковых условиях биохимические и электрокаталитические свойства лакказ, выделенных из культуральных жидкостей различных родов и видов базидиальных грибов.

Предложена схема отбора потенциальных медиаторов лакказ и экспериментальные методы их тестирования, что значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента.

Найден новый класс медиаторов с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5 и показана возможность использования сульфопроизводных 1-фенил-3метил-пиразолона-5 в процессе делигнификации лигноцеллюлозы.

Практическая ценность работы. Впервые в одинаковых условиях проведено комплексное сравнительное изучение лакказ, выделенных из различных источников. Показано, что все исследованные грибные лакказы относятся к высоко редокспотенциальным ферментам и являются высокоактивными как в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров, так и в гетерогенных электрохимических реакциях восстановления дикислорода. Разработана схема отбора органических соединений с целью выявления новых медиаторов лакказ. Найден новый класс соединений – 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые отвечают многим требовани ям, предъявляемым в настоящее время к медиаторам (усилителям действия ферментов), а именно низкая стоимость, экологическая чистота и достаточно высокая эффективность. В работе показано, что сульфопроизводные 1-фенил-3-метилпиразолона-5 могут использоваться в качестве усилителей действия лакказ при ферментативной деградации ксенобиотиков, в частности лигниноподобных веществ. Группа соединений класса 1-фенил-3-метил-пиразолон-5 весьма многочисленна, и введением того или иного заместителя можно добиться значительного улучшения медиаторных свойств конкретного соединения. Проведены лабораторные испытания ЛМС для делигнификации бумажной пульпы.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на конференции «Biocatalysis-2002».

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе 7 статей в ведущих российских и международных научных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (278 наименований). Работа изложена на 139 страницах и содержит 40 рисунков и 11 таблиц.

Сокращения, принятые в тексте. ЛМС – лакказа-медиаторная система; ABTS – диаммониевая соль 2,2’-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой) кислоты;

HABA – 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота; HBT – 1-гидроксибензотриазол;

HPI – N-гидроксифталеимид; PP – 1-фенил-3-метилпиразолон-5; PPA – 1-фенил2,3-диметил-4-аминопиразолон-5; PPA-Na – 1-фенил-3-метил-4-метиламинопиразолон-5-N(4)-метансульфонат натрия; mSPP – 1-(3’-сульфофенил)-3-метилпиразолон-5; pSPP – 1-(4’-сульфофенил)-3-метил-пиразолон-5; VA – вератровый спирт.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, состоящий из трех частей. В первой части рассматривается строение, свойства и каталитический механизм действия лакказ. Во второй части описаны основные усилители действия лакказ и лакказамедиаторные системы. В третьей части рассмотрены возможности использования лакказ и лакказа-медиаторных систем в биотехнологии.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

В работе использовали лакказы, выделенные из культуральных жидкостей базидиальных грибов T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima. Определение молекулярной массы лакказ проводили методом градиентного электрофореза в денатурирующих условиях. Содержание ионов меди определяли бихинолиновым методом [Broman et. al., 1962], а также методом лазерной масс-спектрометрии [Maganadze & Shutyaev, 1993]. Спектральные исследования лакказ проводили с использованием спектрофотометра Coulter DU-650 («Beckman», Германия), спектрофлуофотометра RF-5301 PC («Shimadzu», Япония), ЭПР-спектрометра ESC-(«Bruker», Германия). Определение потенциала Т1 центра лакказ осуществляли методом окислительно-восстановительного титрования, используя в качестве медиаторной пары октоцианомолибдат (IV) и (V) калия [Dutton, 1978; Xu et al., 1996b]. Определение рН-оптимума и каталитических констант ферментативных реакций, катализируемых лакказами, проводили на кислородном электроде типа Кларка. Циклические вольтамперограммы записывали на анализаторе CV 50W («BAS», США) работающем в трехэлектродном режиме (рабочие электроды – стеклоуглерод и спектральный графит, электрод сравнения – хлорсеребряный электрод, вспомогательный электрод – платиновая проволока). Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей, проводили на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония). Для анализа продуктов окисления вератрового спирта (VA) лакказа-медиаторными системами использовали метод гидрофобной обратнофазовой жидкостной хроматографии высокого давления.

Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени удерживания на колонке; их количество в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы “Мультихром” (Россия).

В третьей главе представлены собственные результаты.

Выделение и основные физико-химические свойства лакказ Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima Из культуральных жидкостей базидиальных грибов T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima были выделены в гомогенном состоянии лакказы, основные биохимические характеристики которых представлены в Таблице 1. Как видно из таблицы все изученные лакказы являются гликопротеинами, имеют оптимум рН (при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина) в интервале 3.5-5.2, значения их изоэлектрических точек находятся в кислой области рН. Как и большинство описанных в литературе лакказ, эти ферменты содержат иона меди на 1 молекулу белка. Необходимо отметить, что все изученные лакказы обладают высокой термостабильностью (сохраняют до 50% первоначальной активности через 52-65 часов инкубации при 50оС), что является важным условием для их использования в биотехнологических процессах.

Таблица 1. Некоторые биохимические характеристики лакказ Мм, кДа pI pH-оптимум* Углеводы, % Т1/2**, ч T. hirsuta 70 ± 2 4.2 ± 0.1 3.5-4.5 12 3.7-4.9 10 T. ochracea 64 ± 2 4.7 ± 0.3.5-4.5 13 C. maxima 67 ± 2 3.5 ± 0.3.9-5.2 32 C. fulvocinerea 65 ± 2 3.5 ± 0.* При использовании в качестве субстрата-восстановителя пирокатехина ** Время полуинактивации при 50оС Были определены кинетические параметры реакций, катализируемых этими лакказами для некоторых органических субстратов и ферроцианида калия (Табл. 2). Как видно из таблицы, лакказа T. hirsuta обладала наиболее высокими значениями каталитических констант по отношению к органическим субстратам.

В то же время, лакказа C. maxima показала наибольшее значение kкат при окислении ферроцианида калия.

Таблица 2. Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами* T. hirsuta T. ochracea C. maxima C. fulvocinerea Субстрат kкат, Kм, kкат/ Kм, kкат, Kм, kкат/ Kм, kкат, Kм, kкат/ Kм, kкат, Kм, kкат/ Kм, c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкMмкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c-пирокатехин 390 142 2.75 80 110 0.73 320 120 2.67 90 85 1.гваякол 430 63 6.83 90 90 1.00 300 160 1.88 95 70 1.синаповая кислота 580 24 24.17 170 11 15.45 330 24 13.75 140 21 6.K4Fe(CN)400 180 2.22 150 96 1.56 450 115 3.91 130 170 0.* кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам Оптимум рН для всех изученных лакказ был приблизительно одинаков и находился в интервале рН 3.5–5.0 при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина (Рис. 1А), а кривая зависимости активности от рН раствора имела колоколообразную форму. При использовании ферроцианида калия активность ферментов монотонно падала при изменении рН раствора от 2.5 до 5.5 (Рис. 1Б). Та ким образом, рН-профили активности всех изученных лакказ, при использовании в качестве субстратов как органического, так и неорганического соединения, не отличались от таковых для других лакказ, описанных в литературе.

А Рисунок 1. Зависимость начальной скорости восстановления лакказами молекулярного кислорода от рН реакционной смеси, при использовании в качестве субстрата пирокатехина (А) и K4[Fe(CN)6] (Б):

2.5 3.5 4.5 5.5 6.1 – T. hirsuta, 2 – T. ochracea, 3 – C. fulvocinerea, 4 – C. maxima.

Б Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер;

концентрация пирокатехина – 2мМ, 60 K4[Fe(CN)6] – 10 мМ; концентрация ферментов в реакционной смеси:

(А) 3.3·10-8М (1), 3.2·10-8М (2), 3.8·10-8М (3), 3.4·10-8 М (4); (Б) 1.3·10-8 М (1,2), 1.5·10-8 М (3), 1.4·10-8 М (4).

рН С точки зрения фундаментальных исследований большой интерес представляет структура лакказ и механизма катализа. Активный центр лакказ содержит 4 иона меди, которые подразделяют на три типа по их спектроскопическим характеристикам: Т1 центр – характеризующийся полосой оптического поглощения в области 600 нм и слабым сверхтонким расщеплением в спектрах ЭПР; Т2 центр – не видимый на спектрах поглощения, но характеризующийся на спектрах ЭПР сверхтонким расщеплением; Т3 центр – биядерный диамагнитный медный центр, который может быть идентифицирован на спектрах оптического поглощения по плечу в области 330 нм.

Cпектры поглощения всех изученных в настоящей работе ферментов (Рис. 2) оказались типичными для «голубых» лакказ, описанных в литературе и выделенных из других базидиальных грибов. В них присутствовали сигналы меди Т1 центра (пик поглощения на 610 нм) и биядерного комплекса меди Т3 (плечо в области 330 нм).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»