WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

ПФИА на ПАУ. При разработке ПФИА на полиароматические углеводороды были использованы моноклональные (Clone BAP-13) и поликлональные антитела (Sheep anti-PAH), полученные на иммуногены разной структуры (рис. 15). Поскольку полиароматические углеводороды представляют собой очень широкий класс соединений с различными структурами (рис. 16) и свойствами, требовалось исследовать трейсеры на основе разных ПАУ. В рамках работы были синтезированы трейсеры на основе самого опасного представителя данного класса – бенз(а)пирена, а также пирена и наиболее распространенного ПАУ – нафталина: 1-Pyr-BA-EDF, BAP-BA-EDF и N-Naph-EDA-DTAF (рис. 17).

Y = (B-F)/(Bo-F) O O O Белок Белок Белок N N Иммуноген N Иммуноген H H H Бутиловая кислота бенз(а)пирена+белок Бутиловая кислота бенз(а)пирена+белок моноклональные антитела Сlone BAP-моноклональные антитела Сlone BAP-Белок Белок Белок Иммуноген Иммуноген Азо-производное пирена+белок Азо-производное пирена+белок HO HO HO N N N N N N поликлональная антисыворотка Sheep anti-PAH поликлональная антисыворотка Sheep anti-PAH Рис. 15. Структура иммуногенов для ПФИА на ПАУ Нафталин Аценафтен Аценафтилен Флуорен Антрацен Фенантрен Бензо[k]флуорантен Флуорантен Пирен Хризен Бензо[a]антрацен Дибензо[a,h]антрацен Бенз[a]пире Индено[1,2,3Бензо[b]флуоранте Бензо[g,h,i] cd] пирен перилен Рис. 16. Структуры ПАУ OH OH S S а) а) O O 1-Pyr-BA-EDF 1-Pyr-BA-EDF N N O O N N N H N H H H H H HOOC HOOC O O OH OH S S б) б) O O N BAP-BA-EDF N BAP-BA-EDF N O N O N H N H H H H H HOOC HOOC O O OH OH OH в) в) H H H H H H N N N O N N N O N N N O N-Naphyl-EDA-DTAF N-Naphyl-EDA-DTAF N-Naphyl-EDA-DTAF HN HN HN N N N N N N HOOC HOOC HOOC Cl Cl Cl O O O Рис. 17. Структура трейсеров для ПФИА на ПАУ Тестирование антител на связывание с трейсерами проводили методом построения кривых разведения антител (рис. 18).

Трейсер:

Трейсер:

200 200 120 1-Pyr-BA-EDF 200 120 1-Pyr-BA-EDF BAP-BA-EDF BAP-BA-EDF N-Naphth-EDA-DTAF N-Naphth-EDA-DTAF Трейсер:

Трейсер:

1-Pyr-BA-EDF 1-Pyr-BA-EDF 50 BAP-BA-EDF 50 BAP-BA-EDF N-Naphth-EDA-DTAF N-Naphth-EDA-DTAF 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 Разведение Sheep anti-PAH Разведение Sheep anti-PAH Разведение Clone BAP-Разведение Clone BAP-а) б) Рис. 18. Кривые разведения поликлональной антисыворотки Sheep anti-PAH (а) и моноклональных антител Clone BAP-13 (б) с разными трейсерами Было показано, что все трейсеры способны специфически связываться с каждым из анализируемых антител. Поликлональные антитела Sheep anti-PAH давали более высокий титр. Но не всегда антитела с высоким титром обеспечивают наиболее чувствительный анализ, т.е. чувствительность анализа не находится в прямой зависимости от титра используемых антител. Поэтому в дальнейшем были проверены все возможные комбинации трейсеров с антителами.

mP mP mP mP Sheep-anti-PAH и трейсер BAP-BA-EDF Sheep-anti-PAH и трейсер BAP-BA-EDF Clone BAP-13 итрейсерBAP-BA-EDF Clone BAP-13 итрейсерBAP-BA-EDF mP mP mP mP пирен пирен 20 пирен 20 пирен бенз( а) пирен бенз( а) пирен бенз( a)пирен бенз( a)пирен нафталин нафталин нафталин нафталин антрацен антрацен антрацен антрацен 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 Концентрация стандарта, нг/мл Концентрация стандарта, нг/мл Концентрация стандарта, нг/мл Концентрация стандарта, нг/мл Рис. 19. Градуировочные графики ПФИА на ПАУ После оптимизации концентраций реагентов были получены градуировочные графики для четырех представителей класса полиароматических углеводородов:

бенз(а)пирена, пирена, нафталина и антрацена, и исследованы аналитические характеристики методов (табл. 8,9). Градуировочные графики для одного из трейсеров BAP-BA-EDF представлены на рис. 19.

На основе результатов, приведенных в табл. 8,9, для дальнейшей работы были выбраны следующие оптимальные комбинации:

- пара антитела Clone BAP-13 + трейсер Pyr-BA-EDF – специфична на большие ПАУ;

- пара антитела Sheep-Anti-PAH + трейсер Pyr-BA-EDF – специфична на весь класс ПАУ;

- пара антитела Sheep-Anti-PAH + трейсер N-Naph-EDA-DTAF – специфична на небольшие ПАУ.

Таблица 8. Аналитические характеристики градуировочных графиков ПФИА на ПАУ с моноклональными антителами Clone BAP-Предел Линейный IC50, Трейсер Стандарт обнаружения, диапазон, нг/мл нг/мл нг/мл пирен 32 1,2 10–1-Pyr-BAбенз(а)пирен 44 0,5 5–EDF нафталин, антрацен Нет связывания пирен 753 53 190–BAP-BAбенз(а)пирен 521 42 120–EDF нафталин, антрацен Нет связывания N-Naphпирен, бенз(а)пирен, EDA- Нет связывания нафталин, антрацен DTAF Таблица 9. Аналитические характеристики градуировочных графиков ПФИА на ПАУ с антисывороткой Sheep anti-PAH Предел Линейный IC50, обнаружения, диапазон, Трейсер Стандарт нг/мл нг/мл нг/мл пирен 419 83 120–1-Pyr-BA- бенз(а)пирен 15 0,9 3–EDF нафталин 990 116 300–антрацен 699 8 50–пирен 94 3,8 10–BAP-BA- бенз(а)пирен 348 20 60–EDF нафталин 631 46 180–антрацен 533 76 210–пирен, бенз(а)пирен Нет связывания N-Naphнафталин 42 1,1 9–EDA-DTAF антрацен 114 3,4 30– Предел обнаружения основных представителей ПАУ разработанными методиками составил порядка 1 нг/мл, что практически соответствует предельно допустимой концентрации ПАУ в питьевой воде (0,2 нг/мл).

В результате исследования перекрестного реагирования метода было обнаружено, что:

- пара моноклональные антитела Clone BAP-13 с трейсером 1-Pyr-BA-EDF, полученным на основе пирена, позволяет определять на фоне небольших по размеру и безвредных ПАУ (например, нафталина и фенантрена) канцерогенные бенз(a)пирен, бензо(b)флуорантен, бензо(g,h,i)перилен, бензо(k)флуорантен и индено (l,2,3-cd)пирен;

- использование пары антитела Sheep anti-PAH с трейсером N-Naph-EDA-DTAF, синтезированным на основе нафталина, напротив, дает возможность специфично определять небольшие по объему полиароматические соединения на фоне более крупных ПАУ; эту особенность можно объяснить родственной структурой трейсера;

- пара антитела Sheep anti-PAH c трейсером Pyr-BA-EDF определяет практически весь класс полиароматических углеводородов; на ее основе возможна разработка групп-специфичного анализа.

Таким образом, можно говорить о том, что структура трейсера значительно влияет на специфичность методики.

Преимущество разработанных нами методик состоит в том, что в рамках одного метода возможно проведение как высокоспецифичного анализа на отдельные полиароматические соединения, так и анализа на весь класс веществ в целом.

Апробацию разработанного метода на применимость для исследования реальных образцов проводили методом «введено-найдено». В качестве стандарта брали растворы бенз(a)пирена (как наиболее опасного загрязнителя) с концентрациями 5, 50, 100, 200 и 500 нг/мл в воде из природных источников, после чего проводили тест на открытие. Полученные результаты представлены в табл. 10.

Таблица 10. Тест на открытие бенз(а)пирена в речной воде (антисыворотка Sheepanti-PAH, трейсер Pyr-BA-EDF) Река Воронеж Река Дон Введено, Найдено, Найдено, нг/мл нг/мл % открытия нг/мл % открытия Без добавок <1 <5 80 4 2 6 50 104 52 12 50 100 97 97 3 92 200 110 219 15 225 500 105 527 22 537 На основании этих данных можно утверждать о незначительном влиянии матрикса при определении бенз(a)пирена в воде. Погрешность измерения низких концентраций довольно значительна, однако для быстрого скрининга природных образцов и выявления загрязненных регионов разработанная методика полностью подходит.

Для характеристики взаимодействий в системе антиген-антитело нами были оценены величины констант афинности антител по методу Скетчарда. В таблице представлены рассчитанные константы для обеих антител (для поликлональных антител выделяются 2 фракции: высокоаффинная и низкоаффинная).

Таблица 11. Константы связывания антиген-антитело в ПФИА на ПАУ, рассчитанные методом Скетчарда (определены со средней ошибкой ± 10%) Данные для поликлональной антисыворотки Sheep anti-PAH Костанта связывания, М-Высокоаффинная Низкоаффинная Трейсер Стандарт фракция фракция пирен 9*108 7*бенз(а)пирен 7*1010 5*Pyr-BA-EDF нафталин 3*108 4*антрацен 4*108 3*пирен 9*109 3*бенз(а)пирен 3*108 1*BAP-BA-EDF нафталин 1*108 2*антрацен 2*108 7*пирен, Нет связывания бенз(а)пирен N-Naph-EDADTAF нафталин 2*1010 2*антрацен 5*108 5* Данные для моноклональных антител Clone BAP-Константа связывания, М-Трейсер Стандарт Высокоаффинная фракция пирен 4*Pyr-BA-EDF бенз(а)пирен 1*нафталин, антрацен Нет связывания пирен 5*BAP-BA-EDF бенз(а)пирен 4*нафталин, антрацен Нет связывания N-Naph-EDA- пирен, бенз(а)пирен, Нет связывания DTAF нафталин, антрацен Полученные значения констант связывания для высокоаффинной фракции антител составляют порядка 108-10 моль-1. Наиболее высокие значения констант отвечают системам, для которых был получен наиболее чувствительный ПФИА.

Таким образом, оценка величин констант аффинности позволяет подтвердить специфичность и чувствительность анализа.

ВЫВОДЫ 1. Установлено, что структуры иммунореагентов влияют на чувствительность и специфичность поляризационного флуороиммуноанализа. Выявлено, что для низкомолекулярных соединений со слабыми антигенными детерминантами наиболее важным является выбор углеводородной «ножки» в структуре иммунореагентов. В исследованных случаях оптимальным вариантом оказалось сочетание гомологичных по структуре иммуногена и трейсера, обладающих средней по длине углеводородной ножкой.

2. Изучено влияние метода иммобилизации антител на кремниевом носителе на чувствительность и стабильность микропроточного иммуноферментного анализа на атразин. Наибольшая стабильность и низкий предел обнаружения метода наблюдались в случае ковалентной иммобилизации антител на модифицированном микрочипе.

3. Получены поликлональные антитела и флуоресцеин-меченный трейсер для гербицида ацетохлора и разработан специфичный ПФИА на ацетохлор с пределом обнаружения 9 мкг/л, позволяющий проводить определение атразина в яблочном соке.

4. Подобраны оптимальные иммунореагенты на детергент нонилфенол. Наилучшая чувствительность наблюдалась в случае использования антител, полученных на иммуноген, синтезированный посредством присоединения смеси изомеров НФ к белку-носителю через формальдегид (по реакции Манниха). Впервые был разработан ПФИА на НФ с пределом обнаружения 4 мг/л. Метод был оптимизирован для анализа речной воды. Процент открытия составил порядка 80%.

5. Разработан ПФИА на линейные алкилбензолсульфонаты. Синтезированы трейсеры с разной структурой углеводородной ножки и исследовано их влияние на характеристики анализа. Наиболее чувствительный анализ (с пределом обнаружения 0,5 мг/л) был получен при использовании трейсера, имеющего среднюю по длине и разветвлённости углеводородную ножку и по структуре наиболее близкого к иммуногену. В ряду уменьшения длины углеводородной ножки в структуре трейсера наблюдалось ухудшение его связывания с антисывороткой.

6. Впервые разработан ПФИА на полиароматические углеводороды. Были подобраны оптимальные иммунореагенты и найдены аналитические характеристики метода. Предел обнаружения бенз(а)пирена составил 1 нг/мл. Показано, что при варьировании иммунореагентов возможно получить класс-специфичный или специфичный на одно соединение анализ. Рассчитанные константы связывания антител с трейсером имели значения в диапазоне 108-1010 М-1 и коррелировали с характеристиками чувствительности и специфичности анализа.

7. Разработанные методики, успешно апробированные для анализа реальных образцов, являются перспективными для экспресс-мониторинга объектов окружающей среды и продуктов питания на содержание сурфактантов, пестицидов и полиароматических соединений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. J.N. Yakovleva, R. Davidsson, A.Yu. Lobanova, M. Bengtsson, S.A. Eremin, T.S.

Laurell, J. Emnus. Microfluidic enzyme immunoassay using silicon microchip with immobilized antibodies and chemiluminescence detection. // Analytical Chemistry.

2002. V. 74. N 13. P. 2994–3004.

2. J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova, O.A. Panchenko, S.A. Eremin. Production of antibodies and development of specific polarization fluoroimmunoassay for acetochlor.

// International Journal of Environmental Analytical Chemistry. 2002. V. 82. N 11– 12. P. 851–863.

3. J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova, I.V. Michura, A.A. Formanovsky, M. Franek, J.

Zeravik, S.A. Eremin. Development of a polarization fluoroimmunoassay for linear alkylbenzenesulfonates (LAS). // Analytical Letters. 2002. V. 35. N 14. P. 2279–2294.

4. J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova, E.A. Shutaleva, M.A. Kourkina, A.A. Mart’ianov, A.V. Zherdev, B.B. Dzantiev, S.A. Eremin. Express detection of nonylphenol in water samples by fluorescence polarization immunoassay. // Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2004. V. 378. N 3. P. 634–641.

5. А.Ю. Лобанова, А.В. Жердев, С.А. Еремин. Изучение влияния структуры меченых иммунореагентов на их взаимодействие с антителами и разработка поляризационного флуороиммуноанализа линейных алкилбензолсульфонатов для контроля окружающей среды и продуктов питания. // Сборник статей Школы-конференции «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии». Пущино-Тула, Россия. 28 октября – 3 ноября 2006 г. С. 85–87.

6. I.V. Mikhura, A.A. Formanovsky, A.O. Nikitin, J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova, S.A. Eremin. Immunoreagents for nonylphenol. // Abstracts of the International Scientific Workshop “Biosensors for Environmental Monitoring”. Irkutsk, Russia. July 22–26, 2000. P. 46.

7. J.N. Yakovleva, R. Davidsson, A.Yu. Lobanova, S.A. Eremin, T. Laurell, J. Emnus.

Highly sensitive silicon microchip based flow immunochemical system for detection of pesticides. // Abstracts of the Eighth Symposium on the Chemistry and Fate of Modern Pesticides. Copenhagen, Denmark. August 21–24, 2001. P. 59–60.

8. S.A. Eremin, J.N. Yakovleva, A.Yu. Lobanova. The strategy of antibody preparation and development of a polarisation fluoroimmunoassay for pesticides. // Abstracts of the 5th International Conference on Agri-Food Antibodies. Prague, Czech Republic.

October 2–5. 2001. P. 38.

9. J. Emnus, J.N. Yakovleva, R. Davidsson, A.Yu. Lobanova, S.A. Eremin, M.

Bengtsson, T. Laurell. Highly sensitive silicon microchip based flow immuno biosensor using immobilized affinity proteins and chemiluminescence detection. // Abstracts of the 5th International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems. Monterey, CA, USA. October 21–25, 2001. P. 427– 429.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»