WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

При разработке конкурентного ПФИА на каждый аналит был синтезирован ряд флуоресцентных конъюгатов. Оптимизацию пары реагентов проводили при варьировании структуры гаптена, длины и структуры химической «ножки» и природы флуоресцентной метки в трейсере.

Микропроточный иммуноферментный анализ на атразин (иммуночип) с хемилюминисцентной детекцией. Одним из этапов работы было исследование влияния методов иммобилизации антител на микрочипах на характеристики иммуноанализа.

В качестве подложки для иммобилизации антител использовали кремниевые микрочипы, имеющие общий размер 13.1 х 3.2 мм и 42 проточных канала глубиной 235 мкм и шириной 25 мкм. Дно и стенки каналов имели пористую структуру, а общий объем микрочипа составлял 5 мкл (рис. 4).

Рис. 4. Кремниевый микрочип при разном увеличении С целью оптимизации аналитических параметров иммуночипов для иммобилизации антител использовали ковалентную или нековалентную модификацию поверхности линейным (ЛПЭИ) или разветвленным полиэтиленимином (РПЭИ), а также 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС) (табл. 1, рис. 5).

Таблица 1. Методы иммобилизации антител на кремниевых микрочипах Иммуночип Полимер Фиксация полимера Иммобилизация антител A АПТЭС - Ковалентная B РПЭИ Физическая адсорбция Ковалентная C РПЭИ Ковалентная Ковалентная D ЛПЭИ Физическая адсорбция Ковалентная E ЛПЭИ Физическая адсорбция Физическая адсорбция Иммуночип А Иммуночип А Иммуночип B Иммуночип B Иммуночип C Иммуночип C Иммуночип D Иммуночип D Иммуночип E Иммуночип E Рис. 5. Схемы иммобилизации антител на кремниевых микрочипах Изучение краткосрочной стабильности иммуночипов (стабильность после регенерации) показало, что иммуночипы A, C и D обеспечивают стабильный ХЛ сигнал, а иммуночипы B и E демонстрируют низкую воспроизводимость сигнала связанного трейсера. Оказалось, что физическая адсорбция линейного полимера (иммуночип D) обеспечивает высокую стабильность слоя антител, в то время как адсорбция разветвленного полимера (иммуночип В) приводит к элюции антител и быстрой потере активности микрочипа.

При исследовании долгосрочной стабильности сигнала связывания меченого антигена было установлено, что иммуночип C сохраняет активность в течение месяца, а активность иммуночипа D заметно снижается уже после 2 недель эксплуатации. Таким образом, адсорбция ЛПЭИ на кремниевом микрочипе приводит к формированию наиболее стабильной иммуносенсорной поверхности.

Изучение аналитических характеристик метода (табл. 2) показало, что иммуночипы C и D обеспечивают наиболее чувствительную детекцию атразина в диапазоне нг/л, превосходящую другие известные иммунохимические методы.

Таблица 2. Аналитические характеристики иммуночипов Иммуночип А C D Предел обнаружения, нг/л 24 0.8±0.15 1.6±0.IC50, мкг/л 1.26 0.06±0.05 0.05±0.Линейный диапазон, мкг/л 0.13–30 0.002–2.09 0.003–5.Стабильность – 1 месяц 2 недели ПФИА на ацетохлор. При разработке ПФИА была использована комбинация антител с трейсером гомологичной структуры (рис. 6). Проверку связывания антител с трейсером проводили методом построения кривой разведения антисыворотки и её сравнения с кривой разведения сыворотки неиммунизированного кролика.

O O O Белок Белок Иммуноген Белок Иммуноген S NH S NH S NH O O O N N N O O O O O O ЭДФ ЭДФ ЭДФ Трейсер, гомологичный иммуногену Трейсер, гомологичный иммуногену S NH S NH S NH O O O N N N O O O Рис. 6. Структуры иммунореагентов для ПФИА на ацетохлор Градуировочный график ПФИА на ацетохлор в относительных координатах представлен на рис. 7.

1,1,0,0,mP/mPo mP/mPo 0,0,0,0,0,0,0 10 100 1000 10000 0 10 100 1000 10000 Концентрация ацетохлора, мкг/л Концентрация ацетохлора, мкг/л Рис. 7. Градуировочный график ПФИА на ацетохлор Были рассчитаны аналитические характеристики метода – предел обнаружения составил 9 мкг/л, линейный диапазон градуировочного графика 50 – 5500 мкг/л. Далее проводилось исследование кросс-реактивности методики по отношению к таким пестицидам, как алахлор, пропахлор, метолахлор, бутахлор и диметахлор. Коэффициенты перекрестного реагирования составили 0.1-2%, что позволяет применять разработанный метод для специфического определения ацетохлора на фоне родственных соединений.

Метод был успешно апробирован для определения атразина в яблочном соке.

Для получения достоверных результатов требовалось 20-тикратное разведение сока.

ПФИА на НФ. Для получения антисывороток были использованы иммуногены разной структуры. В первом случае в качестве гаптена использовали непосредственно нонилфенолкарбоновую кислоту (НФ9), которую пришивали к овальбумину. Предполагалось, что антитела способны вырабатываться не только на фенольную часть молекулы, но и на гидрофобный «хвост». Кроме того, такой дизайн иммуногена позволяет избежать связывания полученных антител с фенольными соединениями, не содержащими в своей структуре длинного углеводородного фрагмента.

Второй иммуноген был получен новым методом – посредством присоединения смеси изомеров НФ к белку-носителю через формальдегид (по реакции Манниха). Поликлональные антисыворотки были получены от 8-ми кроликов.

Иммуноген 1. Поликлональная антисыворотка анти-НФИммуноген 1. Поликлональная антисыворотка анти-НФHO HO HO HO NH NH NH NH Белок Белок Белок Белок O O O Иммуноген 2.

Иммуноген 2.

Поликлональные антисыворотки анти-НФ9-#1-Поликлональные антисыворотки анти-НФ9-#1-CH3 CHCH3 CHCH3 CHHO HO HO CHCHCHCH3 CHCH3 CHCH3 CHБелок CHБелок CHБелок CHИммуноген 3.

Иммуноген 3.

Поликлональная антисыворотка анти-п-АФ Поликлональная антисыворотка анти-п-АФ Белок Белок Белок HO HO HO NH NH NH NH NH NH Рис. 8. Структуры иммуногенов для ПФИА на НФ В третьем случае брали гетерологичный нонилфенолу по структуре гаптен – п-аминофенол, пришитый через глутаровый альдегид к белку-носителю. Такой подход был использован, поскольку из литературы известны случаи, когда после введения дополнительной аминогруппы в структуру ножки получаются антитела с высокой аффинностью к определяемому веществу. Амины являются хорошими антигенными детерминантами, поэтому шансы получить антитела, используя в качестве гаптена п-аминофенол, достаточно высоки. Структуры иммуногенов представлены на рис. 8.

Следующим важным моментом в разработке ПФИА является синтез трейсеров. Для исследования влияния структуры трейсера на характеристики анализа были использованы гаптены с разной структурой ножки, чтобы синтезировать ряд трейсеров и выбрать из них лучше всего связывающийся с антителами. Структуры трейсеров представлены на рис. 9. Трейсер НФ3-ЭДФ имеет короткую углеводородную ножку, НФ-7-ЭДФ и НФ9-ЭДФ - длинную ножку между фенолом и флуоресцентной меткой, трейсеры 4AP-ФИТЦ и Тир-ФИТЦ имеют гетерологичную структуру и содержат гетероатомы в ножке.

Тестирование антисывороток на связывание со всеми синтезированными трейсерами проводили методом построения кривых разведения антител и методом спан-анализа - сравнения величины mP нулевого стандарта и стандарта с конценрацией НФ 1 мг/мл; наилучшее связывание наблюдается при наибольшей разнице этих значений. Титры двух антисывороток представлены в табл. 3.

Результаты спан-анализа восьми антисывороток анти-НФ-#1-8 приведены на рис. 10.

S S S S S S NH NH NH NH NH NH HO HO HO HO HO HO NH F NH F NH F NH F NH F NH F NH NH NH NH NH NH O O O O O O НФ3-ЭДФ НФ3-ЭДФ НФ3-ЭДФ НФ3-ЭДФ НФ3-ЭДФ НФ3-ЭДФ S S S S S S HO NH HO NH HO NH HO NH HO NH HO NH F F F F F F NH NH NH NH NH NH NH NH NH NH NH NH O O O O O O НФ9-ЭДФ НФ9-ЭДФ НФ9-ЭДФ НФ9-ЭДФ НФ9-ЭДФ НФ9-ЭДФ S S S S S S OH OH OH OH OH HO HO HO HO HO HO NH NH F NH NH F NH NH F NH NH F NH NH F NH NH F п-АФ-ФИТЦ п-АФ-ФИТЦ п-АФ-ФИТЦ п-АФ-ФИТЦ п-АФ-ФИТЦ п-АФ-ФИТЦ O O O O O F = F = F = NH NH NH NH NH NH HOOC HOOC HOOC HOOC HOOC HO F HO F HO F O O O O O S S S F- флуоресцеин F- флуоресцеин F- флуоресцеин Тир -ФИТЦ Тир -ФИТЦ Тир -ФИТЦ Тир -ФИТЦ Тир -ФИТЦ Тир -ФИТЦ Тир -ФИТЦ Тир -ФИТЦ Рис. 9. Структуры трейсеров для ПФИА на НФ Таблица 3. Титры двух антисывороток для ПФИА на НФ Трейсер / п-АФ- ТирНФ3-ЭДФ НФ7-ЭДФ НФ9-ЭДФ антисыворотка ФИТЦ ФИТЦ анти-п-АФ – – 1/700 – – анти-НФ9 – 1/700 1/2500 – – На основании проведенных исследований было показано, что трейсеры с короткой ножкой – НФ3-ЭДФ, п-AP-ФИТЦ и Тир-ФИТЦ – не дают специфического связывания ни с одной из антисывороток. Из-за наличия в структуре трейсеров НФ7ЭДФ и НФ9-ЭДФ длинной углеводородной ножки, которая экранирует фенольную часть от флуоресцентной метки, эти трейсеры показали хорошее связывание практически со всеми антисыворотками.

После построения градуировочных графиков было определено, что наибольшая чувствительность анализа наблюдаются в случае использования трейсера НФ9-ЭДФ (рис. 11). Аналитические характеристики метода представлены в табл. 4, где IC50 – концентрация стандарта при 50%-м понижении сигнала. Были выбраны иммунореагенты для ПФИА на НФ – антисыворотка анти-НФ9-5 и трейсер НФ9-ЭДФ. Предел обнаружения метода составил 4 мг/л, что попадает в диапазон допустимых концентраций НФ в природных водах (0,18-5 мг/л).

0.0.0.0.1 2 3 4 5 6 7 8 Рис.10. Спан-анализ антисывороток для ПФИА на НФ:

1-8 – антисыворотки анти-НФ9-№1-8;

9 – антисыворотка анти-п-АФ.

0 стандарт 1мг/мл НФ, трейсер НФ7-ЭДФ 1мг/мл НФ, трейсер НФ9-ЭДФ Таблица 4. Аналитические характеристики ПФИА на НФ Пара антисыворотка – Предел Линейный IC50, мг/л трейсер обнаружения, мг/л диапазон, мг/л анти-п-АФ – НФ9-ЭДФ 30 157±10 32-анти-НФ9 – НФ9-ЭДФ 7 53±9 8-анти-НФ9-5 – НФ9-ЭДФ 4 35±5 7- Исследование перекрестного 1,реагирования разработанного ПФИА на НФ с родственными соединениями 0,(коэффициенты перекрестного реагирования составили 0.5-20%) показало возможность применения методики 0,для анализа НФ на фоне фенолов с Антисыворотка - трейсер:

более коротким углеводородным анти-НФ9 - НФ9-ЭДФ 0,остатком, тогда как наличие нониланти-п-АФ - НФ9-ЭДФ фенолполиэтоксилатов и октилфенолов значительно влияет на 0,анализ (коэффициенты перекрестного реагирования 20-80%).

0 1 10 100 Концентрация нонилфенола, мг/л Рис. 11. Градуировочные графики ПФИА на НФ.

Bo – mP «нулевого» стандарта;

B – mP i-го стандарта;

F – mP раствора свободного трейсера mPi/mPo Y = (B-F)/(Bo-F) С целью апробации разработанного метода в образцы речной воды вводили НФ в разных концентрациях, соответствующих линейному диапазону градуировочного графика, после чего проводили тест на открытие методом «введено-найдено». Результаты эксперимента представлены в табл. 5.

Таблица 5. Тест на открытие НФ в речной воде (р. Волга в районе г. Дубны) Введено, мг/л Найдено, мг/л % открытия 10 8±50 40±100 80±На основании полученных данных (тест на открытие для любых концентраций 80%) можно утверждать о незначительном влиянии матрикса при определении НФ в речной воде. Поскольку ПФИА служит для быстрого скрининга природных образцов, его целью является не определение точной концентрации НФ, а выявление загрязненных регионов. Полученные результаты теста на открытие вполне удовлетворяют этим целям.

ПФИА на ЛАС. Для оптимизации анализа были синтезированы трейсеры, имеющие разные по длине и структуре углеводородные ножки. Структуры иммуногенов, использованных для получения антисывороток, и трейсеров представлены на рис. 12,13.

HN БСА ЛАС3-БСА HO3S C O HN ЛАС43-БСА БСА HO3S C O ЛАС42-БСА HN БСА HO3S C O Рис. 12. Структуры иммуногенов для ПФИА на ЛАС Для проверки влияния длины ножки трейсера на его связывание с антисыворотками были построены кривые разведения антисывороток. Титры одной антисыворотки анти-ЛАС-43 со всеми трейсерами приведены в качестве примера в табл. 6.

Таблица 6. Титры антисыворотки анти-ЛАС-43 с разными трейсерами Трейсер ЛАС43- ЛАС42- ЛАС4- ЛАС3- ЛАС2- ЛАС1 ЭДФ ЭДФ ЭДФ ЭДФ ЭДФ ЭДФ Титр 1/500 1/300 1/260 1/230 1/220 1/ S HN HO3S NH NH F ЛАС1-ЭДФ C O S HN NH NH ЛАС2-ЭДФ F HO3S C O S HN ЛАС3-ЭДФ HO3S NH NH F C O S HN NH NH F ЛАС4-ЭДФ HO3S C O S HN HO3S NH NH ЛАС43-ЭДФ F C O S HN ЛАС42-ЭДФ NH NH F HO3S C O Рис. 13. Структуры трейсеров для ПФИА на ЛАС. (F – флуоресцеин) Лучше всего связывается с антисывороткой анти-ЛАС-43 трейсер ЛАС-43ЭДФ, имеющий среднюю по длине и разветвлённости ножку и по структуре наиболее близкий к иммуногену. В ряду уменьшения длины углеводородной ножки в структуре трейсера наблюдается ухудшение его связывания с антисывороткой анти-ЛАС-43. Таким образом, оптимальным является использование трейсера, наиболее подобного по структуре иммуногену.

Для получения градуировочных графиков в качестве стандарта был использован ЛАС, содержащий смесь п-сульфофенилгексановой кислоты с ЛАС, имеющими разные углеводородные фрагменты. Градуировочные графики для антисыворотки анти-ЛАС-43 и разных трейсеров, представляющие собой зависимость относительной величины Y от концентрации ЛАС, представлены на рис. 14.

Наилучший градуировочный график наблюдался в случае гомо- 1,логии иммуногена и трейсера.

Далее провели сравнение градуи- 0,ровочных графиков для разных 0,гомологичных пар трейсер – трейсер:

антисыворотка. Характеристики 0,ЛАС1-ЭДФ градуировочных графиков – пре- ЛАС2-ЭДФ 0, дел обнаружения, IC50 и диапазон ЛАС3-ЭДФ ЛАС4-ЭДФ определяемых концентраций – 0,ЛАС42-ЭДФ приведены в табл.7.

ЛАС43-ЭДФ 0,Исходя из полученных данных, для ПФИА на ЛАС были 0,подобраны оптимальные иммуно- 1E-3 0,01 0,1 1 10 100 реагенты – антисыворотка антиКонцентрация ЛАС, мг/л ЛАС43 и трейсер ЛАС43-ЭДФ.

Рис. 14. Градуировочные графики ПФИА на ЛАС с антисывороткой анти-ЛАСТаблица 7. Характеристики градуировочных графиков ПФИА на ЛАС Предел Диапазон Пара антисыворотка - IC50, обнаружения, определяемых трейсер мг/л мг/л концентраций, мг/л анти-ЛАС-43 – ЛАС430,5 8,6 0,5 0,5–ЭДФ анти-ЛА42 – ЛАС42-ЭДФ 2,5 16 3 2,5–анти-ЛАС3-– ЛАС3-ЭДФ 15 38 9 15–Были рассчитаны аналитические характеристики ПФИА на ЛАС. Предел обнаружения метода составил 0,5 мг/л, что соответствует предельно допустимой концентрации ЛАС в природных водах.

Специфичность метода оценивали, исследуя взаимодействие антисыворотки с алифатическими алкилсульфонатами. Процент перекрестного реагирования составил < 5%, что свидетельствует о высокой специфичности антисыворотки.

Для определения практической применимости метода в образцы речной воды вводили ЛАС в разных концентрациях, после чего проводили тест на открытие методом «введено-найдено». Было показано, что влияние матрикса на анализ незначительно и метод может применяться для определения ЛАС в речной воде.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»