WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Лобанова Анна Юрьевна ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СТРУКТУРЫ МЕЧЕННЫХ ФЛУОРОХРОМАМИ АНТИГЕНОВ НА ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С АНТИТЕЛАМИ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИММУНОАНАЛИЗА ПЕСТИЦИДОВ, СУРФАКТАНТОВ И ПОЛИАРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2006

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор С.А. Еремин

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор А.П. Савицкий доктор химических наук Е.С. Бродский

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН Черноголовка, Московская обл.

Защита состоится «19» декабря 2006 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «18» ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. С каждым годом все более остро встает проблема загрязнения природных объектов и продуктов питания токсичными веществами. В число таких загрязнителей входят пестициды, поверхностно активные вещества (ПАВ) и полиароматические углеводороды (ПАУ).

Хлорсодержащие пестициды широко применяются в сельском хозяйстве и являются распространенными загрязнителями природных вод и почв. Наиболее используемыми в промышленности, в том числе при производстве детергентов, являются представители анионных ПАВ линейные алкилбензолсульфонаты (ЛАС) и широко распространенная группа неионных ПАВ - нонилфенолполиэтоксилаты, которые в процессе биодеградации образуют стабильный продукт нонилфенол (НФ).

ПАВ обладают эстрогенной активностью и значительно изменяют гормональный фон живых существ. ПАУ образуются в результате деятельности химической, металлургической, целлюлозно-бумажной промышленности. Этот класс органических соединений объединяет десятки веществ, для которых характерно наличие в химической структуре двух и более конденсированных бензольных колец.

ПАУ представляют особую опасность, поскольку все эти соединения крайне устойчивы, многие из них являются токсичными, канцерогенными и мутагенными.

ПАУ редко содержатся в пробах как индивидуальные соединения, чаще всего они представлены как сложная смесь, что делает затруднительным их детальный анализ.

В настоящее время для определения вышеперечисленных групп веществ широко применяют в основном традиционные физико-химические методы анализа.

Однако эти методы при высокой чувствительности и точности являются дорогостоящими и требуют длительной пробоподготовки образцов, что совершенно неприемлемо для целей массового скрининга. Поэтому актуальной является разработка высокоспецифичных, надежных и одновременно быстрых и недорогих методов анализа. Этим требованиям удовлетворяют методы иммунохимического анализа, основанные на уникальном специфическом взаимодействии антигенантитело. К наиболее экспрессным и простым в исполнении иммунохимическим методам относится поляризационно-флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА), поэтому в рамках данной работы особое внимание уделялось разработке методик ПФИА.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение закономерностей взаимодействия антител с антигенами и разработка иммунохимических методов анализа ряда ароматических соединений, являющихся загрязнителями окружающей среды. Основная часть работы посвящена ПФИА на пестициды, ПАВ и ПАУ.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

- осуществить синтез иммунохимических реагентов – конъюгатов аналитов с белками и меченных флуоресцеином производных пестицидов, ПАВ и ПАУ;

- изучить влияние структуры иммуногенов на основные характеристики разработанных методов;

- исследовать влияние различных факторов на результаты анализа и выбрать оптимальные условия определения пестицидов, ПАВ и ПАУ методами ПФИА и микропроточного иммуноферментного анализа;

- определить аналитические характеристики разработанных методик и охарактеризовать их использование для определения загрязнителей в реальных объектах.

Научная новизна. Впервые синтезированы различные по структуре и составу конъюгаты производных ацетохлора, ЛАС, НФ и ряда производных ПАУ с флуоресцеином (трейсеры). Впервые получены различные по структуре и составу конъюгаты производных НФ с белками, использованные для наработки антисывороток. Протестированы поликлональные и моноклональные антитела против этих и родственных соединений методом ПФИА. Исследовано влияние длины и разветвленности углеводородной ножки в структуре трейсера и иммуногена на характеристики иммуноанализа. В результате оптимизации структуры иммунореагентов впервые разработаны методики ПФИА на ацетохлор, ЛАС, НФ и ПАУ. Разработаны методики определения атразина, ЛАС, НФ и ряда производных ПАУ в водных образцах.

Практическая значимость работы. На основе полученных иммунореагентов и проведенных исследований впервые созданы методики для экспрессного определения ахетохлора, ЛАС, НФ и ПАУ методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, а также атразина методом микропроточного иммуноферментного анализа. Показано, что данные методы могут быть использованы для количественного определения пестицидов, ПАВ и ПАУ в водных образцах различного происхождения.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: Международная конференция студентов и аспирантов фонда И.В. Березина (Москва, Россия, 2000); Международное научное совещание “Применение биосенсоров в мониторинге окружающей среды” (Иркутск, Россия, 2000); Eighth Symposium on The Chemistry and Fate of Modern Pesticides (Copenhagen, Denmark, 2001); Fifth International Conference on Agri-Food Antibodies (Prague, Czech Republic, 2001); Fifth International Conference on Miniaturized Chemical and Biochemical Analysis Systems (Monterey, USA, 2001); SETAC Conference “Organic Soil Contaminants” (Copenhagen, Denmark, 2001); Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология – современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, Россия, 2006).

В 2002 году автор стал лауреатом конкурса «Грант Москвы» в области наук и технологий в сфере образования.

Результаты, полученные в ходе работы, были применены при выполнении государственного контракта 02.434.11.7123 (заказчик – Федеральное агентство по науке и инновациям).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 5 статей в ведущих международных и российских журналах, 5 тезисов сообщений на научных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 112 ссылок.

Работа изложена на 94 страницах, содержит 35 рисунков и 21 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы и объекты исследования. В работе были использованы пестициды ацетохлор и атразин, линейные алкилбензолсульфонаты, нонилфенол, паминофенол, 16 полиароматических углеводородов производства фирмы Sigma (рис.

1). Поликлональные кроличьи антисыворотки против п-аминофенола и против производного нонилфенола получены на кафедре химической энзимологии, химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в Институте биохимии им.

А.Н. Баха РАН, соответственно. Овечьи антисыворотки против НФ и ПАУ были предоставлены R. Abuknesha (Кинг Колледж, Лондон, Великобритания).

Моноклональные антитела против ПАУ были получены в лаборатории D. Knopp (Технический университет г. Мюнхена, Германия). Поликлональные антисыворотки против ЛАС были предоставлены M. Franek (Исследовательский институт ветеринарии, Брно, Чехия).

В качестве объектов исследования использовали образцы воды из р. Волга в районе г. Дубны (Московская обл.), из р. Дон в районе г. Ростова-на-Дону и из реки Воронеж в районе г. Липецка. Также был использован яблочный сок, поступающий в торговую сеть г. Москвы.

H H H H3-(CH2)n (CH2)m-CH3 Cl H3-(CH2)n (CH2)m-CH3 Cl H3-(CH2)n (CH2)m-CH3 Cl C C C Атразин Атразин N N N N N N N N N iPr - HN NH-Et iPr - HN NH-Et iPr - HN NH-Et ЛАС ЛАС SO3Na SO3Na SO3Na O O O Cl Cl Cl N N N O O O ПАУ Ацетохлор ПАУ Ацетохлор НФ НФ HO HO HO HO Рис. 1. Химические структуры анализируемых соединений Синтез иммунореагентов. Конъюгаты карбоксильных производных анализируемых соединений с аминопроизводными флуоресцеина, называемые в дальнейшем трейсерами, и белками-носителями были синтезированы по методу активированных эфиров.

Поляризационный флуоресцентный анализ (ПФИА). В качестве рабочей концентрации трейсера использовали концентрацию, при которой интенсивность флуоресценции раствора трейсера в 10 раз превышает интенсивность флуоресценции буфера. Рабочую концентрацию антисыворотки определяли как разведение при 70%-ном связывании трейсера.

В кювету к 50 мкл стандартного раствора или анализируемой пробы добавляли 50 мкл раствора трейсера и 50 мкл антител в рабочем разведении и 350 мкл 2,5 мМ боратного буфера, содержащего 0,1% азида натрия. Кювету помещали в поляризационный флуориметр «Beacon 2000» (Panvera, США) и проводили измерение поляризации флуоресценции (mP).

Микропроточный иммуноферментный анализ с хемилюминесцентной (ХЛ) детекцией (микрочипы). Кремниевые микрочипы с иммобилизованными антителами помещали в проточную ячейку из плексигласа и собирали проточную систему, состоящую из насосов для подачи несущего и регенерирующего буферов, инжектора с объемом петли 4-7 мкл, детектора и компьютера. Иммуноанализ проводили по конкурентной схеме. В систему инжектировали раствор конъюгата пероксидаза-атразин и стандартный раствор атразина (50 мкл/мин). Смесь инкубировали на поверхности иммуночипа в течение 0-5 мин и отмывали несвязавшиеся компоненты 50 мМ буфером ТРИС/HCl (рН 7.4) в течение 2 мин. Для детекции ХЛ сигнала связанной фракции трейсера на поверхности микрочипа в систему инжектировали субстратную смесь (50 мкМ люминол, 0.25 мМ 4-иодофенол и 1.5 мМ пероксид водорода в 50 мМ ТРИС/HCl, рН 9.0) и регистрировали интенсивность света с помощью фотоумножителя (“Hamamatsu Photonics K.K.”, Япония). В завершение цикла анализа связанные компоненты десорбировали с поверхности иммуночипа, пропуская регенерирующий буфер (0.4 М глицин/HCl, рН 2.2) в течение 3 мин, затем чип промывали 50 мМ ТРИС/HCl. Полный цикл анализа по вышеописанной схеме занимает 10 мин.

Данный цикл исследований проводился в Химическом Центре Университета г. Лунд (Швеция) совместно с проф. J. Emnus и к.х.н. Ю.Н. Яковлевой.

Рассчет констант аффинности антител. При определении констант афинности в представляемой работе был использован метод Скетчарда. Расчет производили по градуировочному графику (рис. 2), построенному в логарифмических координатах по оси x. Данная зависимость имеет обращенный S-образный вид. Значение mP верхнего плато должно совпадать со значением mP для выбранного рабочего разведения антител. Нижнее плато по величине mP должно совпадать с нижним плато на кривой разведения антител, поскольку при его достижении весь трейсер находится в свободной форме.

При взаимодействии антиген (Аг) – антитело (Ат) система уравнений материального баланса выглядит следующим образом [Aт]0 = [Aт] + [AгAт] K Aг + Aт AгAт [Aг]0 = [Aг] + [AгAт] [AгAт] K = Используя эти уравнения и учитывая, что:

[Aг][Aт] для равновесной концентрации комплекса получаем выражение:

K[Aт]0 [Aг] [AгAт] = 1 + K[Aг].

Используя описанную зависимость, можно рассчитать константу связывания образовавшегося комплекса. Так, координаты Скетчарда представляют собой зависимость отношения [AгAт]/[Aг] от [AгAт]. Тангенс угла наклона полученного графика представляет собой взятое с обратным знаком значение константы комплексообразования (рис. 3).

[AгAт] K[Aт][AгAт] K[Aт][Aг] [Aг] tg = -K tg = -K [Aт][Aт]0 0,01 1 100 0 0,01 1 100 [AгAт] [AгAт] Концентрация стандарта, М Концентрация стандарта, М Рис. 2. Зависимость степени поляризации Рис. 3. Зависимость Скетчарда флуоресценции (mP) от концентрации антигена.

Используя в работе поляризационную флуоресцентную детекцию, определение констант связывания по Скетчарду проводили исходя из формулы отношения свободной и связанной форм антигена:

B mP - mPmin = F mPmax - mP в которой mP, mPmin, mPmax - соответственно промежуточное, минимальное и максимальное значения поляризации флуоресценции.

Для расчета использовали значения mPmin и mPmax из кривой разведения антител, т.к. в градуировочном графике, в отличие от кривой разведения, в области верхнего плато трейсер связан не полностью, а в соответствии с выбранным титром (в нашем случае – на 70%).

Обозначив общее количество меченого и немеченого антигена в системе как СAг, получаем выражение для концентрации свободной формы антигена.

C = B + F A г B B F = CAг - B = X = X CAг - B F B и F – связанная и свободная формы антигена, соответственно.

Отсюда имеем:

X mP - mPmin B = C = C Aг X + 1 mPmax - mPmin A г Далее строили зависимость Скетчарда B/F от B и по графику определяли константу афинности антител.

mP mP РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение иммунореагентов. Антитела являются ключевым реагентом для разработки любого иммуноанализа. Задачей настоящей работы было получение и оптимизация наборов иммунореагентов для количественного определения вышеперечисленных соединений, представленных на рис. 1. При этом для получения поликлональных антител против п-аминофенола (для ПФИА на НФ) использовали впервые синтезированные нами иммуногены – конъюгаты п-аминофенола с белками.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»