WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

А. Изменения ультраструктуры мембран митохондрий в условиях аноксии При электронно-микроскопическом исследовании ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 24 ч, было обнаружено, что на фоне практически неизмененной общей морфологии кардиомиоцитов происходят изменения в ультраструктуре митохондриального аппарата (рис 1).

Возникает гетерогенность популяции митохондрий. Часть популяции составляют набухшие митохондрии с обводненным, просветленным матриксом. Мембраны крист таких митохондрий имеют низкую электронную плотность, кристы утрачивают взаимнопараллельную ориентацию. Наряду с этим в ткани присутствуют электронно-плотные митохондрии с незначительно обводненным межмембранным пространством, электронноплотным матриксом, со взаимопараллельно расположенными кристами.

Количество межмитохондриальных контактов в ткани, инкубированной 24 ч в условиях аноксии, соответствует норме.

Б. Основные стадии изменений системы окислительного фосфорилирования в условиях аноксии Исследовалась функциональная активность митохондрий, выделенных из ткани миокарда на различных этапах инкубации в условиях аноксии. Было показано, что функция дыхательной системы митохондрий полностью сохраняется в течение 24 ч инкубации. Максимальная скорость дыхания на субстратах, как первого, так и второго комплексов дыхательной цепи не снижается относительно контроля (рис 3А, табл. 1). При этом фосфорилирующая функция митохондрий полностью нарушена: добавление АДФ не стимулирует скорости дыхания, мембранный потенциал () после добавления субстратов дыхания незначительно возрастает, но затем быстро спонтанно спадает (рис 3А). При более длительной инкубации ткани миокарда в аноксии (72 ч) полностью подавляется малатоксидазная активность митохондрий, но сукцинатоксидазная активность остается без изменений (рис 3Б, табл. 1). В результате было показано, что система окислительного фосфорилирования митохондрий быстро разобщается в процессе инкубации ткани в условиях аноксии. При этом функция дыхательной цепи сохраняется длительное время: сукцинатоксидазная активность регистрируется через 72 ч инкубации, а малатоксидазная активность через 24 ч инкубации.

Таблица 1. Максимальные скорости дыхания митохондрий Препарат митохондрий Субстраты Скорость дыхания N дыхания (нг ат О/ мг белка) Интактные митохондрии* глут. +мал. 124 22 сук.+рот. 127 25 Митохондрии, выделенные из ткани глут. +мал. 120 26 микарда, инкубированной 24 ч в сук.+рот. 128 25 аноксии** Митохондрии, выделенные из ткани глут. +мал. 5 5 микарда, инкубированной 72 ч в сук.+рот. 125 30 аноксии** - среднеквадратичное отклонение N- количество экспериментов *- дыхание в состоянии 3 по Чансу **- дыхание не стимулируется разобщителем и АДФ Рисунок 3. Дыхание (верхние кривые) и мембранный потенциал (нижние кривые) митохондрий, выделенных из (А) ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 24 ч; (Б) ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 72 ч; (В) свежей ткани (контроль); (Г) ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 24 ч в среде, содержащей 100 мкМ циклоспорина А; (Д) ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 24 ч в среде, содержащей 1 мМ спермина. Инкубацию проводили в средах с низкой ионной силой. Добавки: Mit- митохондрии, 0.5 мг белка, ADP –АДФ, rot – ротенон 1 мкМ, suc – сукцинат 10мМ, FCCP – FCCP 0.2 мкМ, KCN- 1мМ KCN, глутамат и малат содержался в среде инкубации.

В. Пермеабилизация мембран митохондрий в условиях аноксии Исследование механизма разобщения системы окислительного фосфорилирования митохондрий показало, что данное нарушение подавляется циклоспорином А. Добавка циклоспорина А в среду инкубации ткани перед герметизацией пробирок предотвращает нарушение фосфорилирующей активности и падение, наблюдаемое через 24 ч инкубации ткани в условиях аноксии (рис. 3Г). Для того чтобы обеспечить быструю диффузию циклоспорина А в ткани миокарда, он добавлялся в систему в высокой концентрации 100 мкМ. Таким образом было показано, что в основе механизма разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях в составе ткани миокарда в условиях аноксии лежит эффект пермеабилизации внутренней мембраны, в результате открывания циклоспорин А-чувствительной поры.

Г. Связывание цитохрома с с митохондриями в составе ткани и в суспензии, в условиях открытой неспецифической поры Известно, что индукция открывания неспецифической поры часто приводит к выходу цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий. Для того чтобы определить, происходит ли выход цитохрома с из митохондрий в составе ткани миокарда в наших условиях было проведено иммуногистохимическое исследование. Оказалось, что после 24 ч инкубации срезов в аноксических условиях, когда открывается неспецифическая пора, выход цитохрома с из митохондрий не наблюдается (Рис 4А) и распределение плотности этого белка в клетке остается таким же, как в контроле (Рис 4C). Однако поскольку срезы инкубировались в среде с низкой ионной силой, существовала возможность того, что значительная часть ионов калия выходит из цитоплазмы в процессе эксперимента. В таких условиях цитохром с прочно сорбируется на внутренней мембране митохондрий за счет усиления электростатического взаимодействия. Поэтому была проведена серия опытов в среде с высокой ионной силой (60 мМ KCl). Такой ионной силы достаточно для удаления значительной части цитохрома с из митохондрий с искусственно нарушенной внешней мембраной (митопластов) (табл. 2). В этих опытах высвобождения цитохрома с из митохондрий так же не было зарегистрировано (рис 4B). Эти результаты позволяют заключить, Рисунок 4. Иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани миокарда антителами на цитохром с (зеленый) и Hoechst 33342 (синий). (A) Ссрезы инкубировали в среде с низкой ионной силой 24 ч в условиях аноксии; (B) срезы инкубировали в среде с высокой ионной силой (60 мМ KCl) 24 ч в условиях аноксии; (C), контроль (срезы свежей ткани миокарда). Из фотографии видно, что цитохром с локализован в митохондриях, распределение его плотности одинаково в опыте и в контроле.

Рисунок 5. Определение содержания цитохрома с в препаратах митохондрий и митопластов, полученных в средах с низкой ионной силой (комментарии в тексте).

Спектры оптического поглощения суспензий митохондрий, митопластов и супернатантов в области 525-580 нм: (А) – суспензия митопластов, полученных из контрольных митохондрий; (Б) – те же митопласты, переосажденные из среды с высокой ионной силой (120 мМ KCl); (В) – контрольные митохондрии, переосажденные из среды с высокой ионной силой (120 мМ KCl); (Г) – митохондрии, выделенные из ткани миокарда, инкубированной в аноксии 24 ч в среде с низкой ионной силой; (Д) – контрольные митохондрии; (Е) – митохондрии, выделенные из ткани миокарда, инкубированной в аноксии 24 ч в среде с высокой ионной силой (мМ KCl); (Ж) – митохондрии, выделенные из ткани миокарда, инкубированной в аноксии 24 ч в среде с низкой ионной силой и переосажденные из среды с высокой ионной силой (120 мМ KCl); (З) – митохондрии, выделенные из ткани миокарда, инкубированной в аноксии 24 ч в среде с низкой ионной силой в присутствие мкМ циклоспорина А, переосажденные из среды с высокой ионной силой (120 мМ KCl). (а) – суспендированные осадки, (б) – супернатанты.

что в ткани миокарда цитохром с может удерживаться в митохондриях в условиях открывания неспецифической поры. При исследовании свойств внешней мембраны митохондрий, выделенных из ткани миокарда после 24часовой инкубации в аноксии было обнаружено, что она проницаема для цитохрома с. Относительное содержание цитохрома с в суспензии митохондрий измерялось спектрофотометрически по соотношению величин оптического поглощения цитохромов с и b (A550/A560). Для того чтобы предотвратить выход цитохрома с из митохондрий с поврежденной внешней мембраной в процессе выделения, было использовано свойство этого белка прочно связываться с внутренней мембраной в среде с низкой ионной силой.

В контрольных экспериментах было показано, что в таких условиях цитохром с прочно сорбирован на внутренней мембране митохондрий за счет электростатических взаимодействий и не отрывается от митопластов, полученных из митохондрий путем воздействия осмотического шока (рис 5А). При ресуспендировании митопластов в среде с высокой ионной силой цитохром с отрывается от поверхности мембраны и практически полностью уходит в водную фазу (рис 5Б). Было показано также, что в нормальных условиях внешняя мембрана контрольных митохондрий может повреждаться в процессе выделения, однако доля митохондрий с поврежденной внешней мембраной в этом случае не превышает 20 % (рис 5В). Эксперименты на митохондриях, выделенных в безионной среде, из ткани миокарда инкубированной 24 ч в среде как с низкой, так и с высокой ионной силой в условиях аноксии показали, что количество цитохрома с в таких митохондриях такое же, как в контроле (рис 5Г,Д,Е, табл. 2). Таким образом, эти эксперименты еще раз подтвердили вывод о том, что в условиях аноксии в ткани сердца цитохром с удерживается в митохондриях, несмотря на открывание неспецифической поры, и это удержание не связано с сорбцией данного белка на внутренней мембране. Полученные митохондрии были переосаждены в среде с высокой ионной силой. В результате наблюдался почти полный выход цитохрома с в супернатант (рис 5Ж) такой же, который наблюдается при аналогичной обработке митопластов (рис 5Б). Этот результат говорит о том, что в условиях открывания неспецифической поры при аноксии, свойства выделенных митохондрий качественно отличаются от свойств митохондрий в составе ткани. Повышение ионной силы приводит к выходу цитохрома с из выделенных митохондрий. В то же время, в митохондриях в составе ткани в таких условиях цитохром с остается в межмембранном пространстве (рис 4В). Возможно, этот эффект связан с тем, что при выделении митохондрий происходит реоксигенация, при этом становится возможным окисление кардиолипина, что является необходимым условием для выхода цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий (Kagan et al, 2005).

Д. Два механизма нарушения интактности внешней мембраны митохондрий миокарда в условиях аноксии Выше было указано, что инкубация ткани в условиях аноксии вызывает открывание неспецифической поры в митохондриях – добавка циклоспорина А предотвращала сброс на внутренней мембране. Обычно при открывании поры в аэробных условиях наблюдается выход цитохрома с из митохондрий, который блокируется циклоспорином А (Knorre, et al 2003).

Важно было определить, способен ли циклоспорин А предотвращать выход цитохрома с из митохондрий, выделенных из ткани сердца инкубированной в условиях аноксии 24 часа. Было показано, что в отличие от аэробных условий при аноксии добавка циклоспорина А в среду инкубации ткани не предотвращала нарушение интактности внешней мембраны выделенных митохондрий (рис 5З). Однако при этом циклоспорин А блокировал сброс. Таким образом, было установлено, что в условиях аноксии индуцируются два пути нарушения интактности внешней мембраны митохондрий. Один из них связан с открыванием неспецифической поры, другой очевидно не связан с этим процессом и наблюдается в явном виде только на выделенных митохондриях.

Таблица 2. Соотношение значений оптической плотности в максимумах спектров поглощения цитохромов с и b (A550/A560) в суспензии митохондрий Тип суспензии митохондрий A550/A N Интактные митохондрии 1.62 0.05 Митопласты 1.61 0.04 Митохондрии, выделенные из ткани миокарда, 1.62 0.03 инкубированной в аноксии 24 часа в среде с низкой ионной силой Митохондрии, выделенные из ткани миокарда, 1.64 0.06 инкубированной в аноксии 24 часа в среде с высокой ионной силой (60 мМ KCl) Митопласты, переосажденные в среде с ионной силой 60 мМ 0.95 0.06 KCl - среднеквадратичное отклонение N- количество экспериментов 3. Динамика и особенности молекулярного механизма индукции “цитохром с – независимого” апоптоза в ткани миокарда в условиях аноксии Известно, что сильное снижение парциального давления кислорода (гипоксия) приводит к индукции апоптоза в ткани миокарда и в культуре кардиомиоцитов. Представлялось интересным выяснить вопрос о том, может ли возникать апоптоз в ткани миокарда в условиях полного отсутствия кислорода (при аноксии). В данном разделе показано, что в условиях аноксии в ткани миокарда индуцируется тип апоптоза, который не связан с выходом цитохрома с из митохондрий. Наблюдалось, что индукция такого вида апоптоза жестко сопряжена с открыванием неспецифической поры митохондрий. Приведена вероятная последовательность реакций, протекающих при индукции апоптоза в условиях аноксии.

А. Динамика индукции апоптоза в ткани миокарда в условиях аноксии Известно, что одной из специфических стадий апоптоза является межнуклеосомная фрагментация ДНК. Исследование динамики распада ДНК в ткани миокарда в условиях аноксии показало, что межнуклеосомная фрагментация ДНК развивается в течение первых трех суток (рис. 6АБ). Этот процесс протекает относительно равномерно. Через трое суток полностью распадается высокомолекулярная ДНК и в системе остаются только низкомолекулярные фрагменты. Данные наблюдения свидетельствуют об относительно медленном протекании процесса апоптоза в наших условиях по сравнению с апоптозом при реоксигенеции (Gottlieb, et al 2002). Известно, что одним из этапов большинства типов апоптоза является выход цитохрома с из митохондрий, однако как указывалось в предыдущей главе, что этот белок не выходит из митохондрий в наших условиях.

Рисунок 6. Электрофореграмма препарата ДНК, выделенного из срезов ткани миокарда, инкубированных в условиях аноксии 24-72 ч. (A) Инкубацию проводили в среде с низкой ионной силой 24 ч (1), 48 ч (2), 72 ч (3), молекулярный маркер (M). (Б) Инкубацию проводили в среде с высокой ионной силой 24 ч (1), 48 ч (2), 72 ч (3). (В).

Инкубацию проводили в среде с низкой ионной силой 24 ч, добавлен циклоспорин А мкМ (1), 50 мкМ (2), 100 мкМ (3), без добавок (4). (Г). Инкубацию проводили в среде с низкой ионной силой 24 ч, добавлен спермин 1 мМ (1), 0.5 мМ (2), 0.25 мМ (3), без добавок (4).

Таким образом, в аноксии наблюдается особый тип клеточной гибели – «цитохром с – независимый апоптоз», который равномерно развивается в течение первых трех суток. В этой связи важно подчеркнуть, что в среде с высокой ионной силой (в условиях, когда выход цитохрома с из митохондрий не ограничен его электростатическим взаимодействием с поверхностью внутренней мембраны) скорость фрагментации ДНК приблизительно такая же, как и в безионных средах.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»