WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Рис. 18. Зависимость интенсивности Интересно, что параметр t0 при увеличении светорассеяния от гидродинамического радиуса (Rh), полученная для разных концентрации -кристаллина не увеличивается концентраций АДГ в процессе в отличие от других белков (ГАФД и агрегации при 56 °C. Концентрация АДГ составляла: (1) 0.025, (2) 0.05, (3) 0.1, (4) -кристаллина).

0.2 и (5) 0.3 мг/мл.

Из литературных данных известно, что в аминокислотной последовательности дрожжевой АДГ I содержится гидрофобный участок (YSGVCHTDLHAWHGDWPLPVK, 40-60), который в ферменте, денатурированном А 4000 Б 0 0 20 40 60 80 0 40 80 120 t (мин) t (мин) В Г 0 200 400 600 0 200 400 600 t (мин) t (мин) Рис. 19. Влияние -кристаллина на размер агрегатов, образующихся при нагревании АДГ I (0.2 мг/мл) при 56 °C. Зависимость гидродинамического радиуса Rh от времени, полученная в отсутствие -кристаллина (A) и в присутствии 0.015, 0.03 и 0.045 мг/мл -кристаллина (Б, В и Г, соответственно). Начальные участки зависимости Rh от времени описаны кривыми, рассчитанными с помощью уравнения (2).

I (фотоотсчет/с) h h R (нм) R (нм) h h R (нм) R (нм) нагреванием, способен связываться с -кристаллином [Santhoshkumar and Sharma, 2002]. У выделенного пептида 40-60 была обнаружена шапероноподобная активность [Bhattacharyya et al., 2003]. На рис. 20 показана модель пептида Y40-K60, отвечающего за шапероноподобную активность, расположенного в составе субъединицы. Из данных по агрегации АДГ I, приведенных выше, можно заключить, что АДГ I довольно устойчива к нагреванию при 56 °C. Кинетика тепловой агрегации АДГ I характеризуется длительным лаг-периодом. Помимо этого, унимодальное распределение агрегатов по мере нагревания переходит в бимодальное (расщепление агрегатов на два компонента). Можно предположить, что АДГ I предотвращает собственную агрегацию при нагревании или при воздействии какого-либо денатурирующего агента вследствие экспонирования в окружающую среду гидрофобной последовательности Y40-K(внутримолекулярного шаперона) после частичного разворачивании белковой молекулы.

Исходя из установленного нами механизма защитного действия шаперонов, можно полагать, что благодаря наличию пептида Y40-K60 стартовые агрегаты, образуемые денатурированной АДГ I, характеризуются Рис. 20. Трехмерная структура субъединицы АДГ I из Saccharomyces меньшим размером по сравнению с тем, cerevisiae. Красным цветом обозначен который бы они имели при отсутствии пептидный участок (Y40-K60), обладающий свойствами шаперона.

внутримолекулярного шаперона. Стартовые Модель получена Де Болле (X. De Bolle, агрегаты, образуемые денатурированной АДГ I, Departement de Biologie, Facultes Universitaires Notre-Dame de la Paix, ведут себя так же, как и стартовые агрегаты, Namur, Belgium).

содержащие шаперон: вероятность слипания взаимодействующих частиц при соударении меньше единицы.

На основании полученных данных сформулирован новый механизм агрегации белков и механизм подавления агрегации белков -кристаллином. На рис. 21 показан механизм агрегации денатурированного белка, включающий стадию формирования стартовых агрегатов, стадию слипания стартовых агрегатов (первичных кластеров) и агрегатов более высокого порядка (рост фрактального агрегата). Такой путь агрегации происходит в режиме DLCA (каждое столкновение приводит к слипанию взаимодействующих частиц) и, в конечном итоге, приводит к появлению структур огромных размеров, склонных к преципитации. В присутствии -кристаллина агрегация белка подавляется за счет уменьшения размера стартовых агрегатов. Вероятность слипания при соударении таких частиц становится меньше единицы. Таким образом в присутствии -кристаллина происходит переход процесса агрегации из режима DLCA в режим RLCA.

Рис. 21. Модель, описывающая механизм агрегации белков через стадию образования стартовых агрегатов.

ВЫВОДЫ 1. С использованием метода динамического лазерного светорассеяния изучена кинетика тепловой агрегации L-кристаллина из хрусталика глаза быка, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из мышц кролика, транскетолазы и алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae. Контроль за стадией денатурации белков осуществляли при помощи метода дифференциальной сканирующей калориметрии.

2. Предложен новый механизм агрегации белков, приводящей к образованию аморфных агрегатов. Этот механизм включает стадию образования стартовых агрегатов и следующую за ней стадию слипания стартовых агрегатов, ведущую к образованию крупных агрегатов, склонных к преципитации. Предложен метод оценки размеров стартовых агрегатов. Метод основан на построении графика зависимости интенсивности светорассеянии (I) от гидродинамического радиуса (Rh). Гидродинамический радиус стартовых агрегатов определяется как отрезок, отсекаемый на оси абсцисс линейной зависимостью I от Rh.

3. Проанализирован характер зависимости гидродинамического радиуса от времени для тепловой агрегации L-кристаллина и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы.

Распределение частиц по размерам остается унимодальным в ходе агрегации. Начальные участки зависимостей Rh от времени являются линейными. При достаточно больших временах зависимости Rh от времени подчиняются степенной функции с величиной фрактальной размерности агрегатов (df), близкой к 1.8. Сделан вывод, что агрегация протекает в режиме «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» (кинетический режим, при котором каждое столкновение приводит к слипанию взаимодействующих частиц).

4. С использованием метода аналитического ультрацентрифугирования установлен диссоциативный механизм тепловой денатурации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

5. На примере -кристаллина (белка, обладающего шапероноподобной активностью) предложен новый механизм подавления агрегации белков шаперонами. Включение -кристаллина в стартовые агрегаты приводит к уменьшению их размера и снижению вероятности слипания взаимодействующих частиц при их столкновении (переход процесса агрегации в режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation»).

6. Показано, что анализ зависимости гидродинамического радиуса от времени позволяет выявить белки, которые в развернутом состоянии проявляют шапероноподобную активность (т.е. защищают себя от агрегации). Примером может служить дрожжевая алкогольдегидрогеназа I.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ, Программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и международным фондом INTAS.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. H.A. Khanova, K.A. Markossian, B.I. Kurganov, A.M. Samoilov, S.Yu. Kleimenov, D.I.

Levitsky, I.K.Yudin, A.C. Timofeeva, K.O. Muranov, and M.A. Ostrovsky. Mechanism of chaperone-like activity. Suppression of thermal aggregation of L-crystallin by -crystallin.

Biochemistry, 2005, v. 44, p. 15480-15487.

2. О.А. Есакова, Е.А. Ханова, Л.Е. Мешалкина, Р. Голбик, Г. Хюбнер, Г.А. Кочетов. Влияние субстратов транскетолазы на реконструкцию и стабильность холофермента. Биохимия 2005, т. 70, N 7, 770-776.

3. K.A. Markossian, B.I. Kurganov, D.I. Levitsky, H.A. Khanova, N.A. Chebotareva, A.M.

Samoilov, T.B. Eronina, N.V. Fedurkina, L.G. Mitskevich, A.V. Merem’yanin, S.Yu.

Kleymenov, V.F. Makeeva, V.I. Muronetz, I.N. Naletova, I.N. Shalova, R.A. Asryants, E.V.

Schmalhausen, L. Saso, Yu.V. Panyukov, E.N. Dobrov, I.K. Yudin, A.C. Timofeeva, K.O.

Muranov, and M.A.Ostrovsky. Mechanism of chaperone-like activity. «Protein Folding: New Research». Nova Science Publishers, Inc., New York, USA (Obalinsky, T.R., Ed.), 2006, p. 89171.

4. K.A. Markossian, H.A. Khanova, S.Yu. Kleimenov, D.I. Levitsky, N.A. Chebotareva, R.A.

Asryants, V.I. Muronetz, L. Saso, I.K. Yudin, B.I. Kurganov. Mechanism of thermal aggregation of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry, 2006, v. 45, p.

13375-13384.

5. Е.А. Ханова, А.K.Тимофеева, А.М. Самойлов, К.А. Маркосян, К.О. Муранов,М.А.

Островский, Д.И. Левицкий, Б.И. Курганов. Кинетика тепловой агрегации дрожжевой алкогольдегидрогеназы в присутствии -кристаллина. Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». Тюмень, 2005 г., стр.

80-82.

6. А.К Тимофеева, Е. А. Ханова, К.А. Маркосян, К.О. Муранов, М.А. Островский, Б.И.

Курганов. Кинетика тепловой агрегации -кристаллина хрусталика глаза быка в присутствии -кристаллина. Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». Тюмень, 2005 г., стр. 29-32.

7. Е.А. Ханова. Тепловая агрегация дрожжевой алкогольдегидрогеназы. XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2005. Тезисы докладов, стр. 86.

8. Е.А. Ханова, А.K.Тимофеева, А.М. Самойлов. Влияние -кристаллина на кинетику тепловой агрегации -кристаллина. XII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005», Москва, 2005. Тезисы докладов, стр.

239-240.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»