WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Гидродинамический радиус стартовых агрегатов (Rh,0) 0 50 100 150 200 Rh(нм) остается практически постоянным в интервале температур от 37 до 55 °C (Rh,0 21 нм; 10 мM Na-фосфатный буфер, pH 7.5). Как видно из вставки на рис. 10Б, начальные участки зависимостей Rh от времени линейны. Пунктирная горизонтальная линия на вставке рис. 9Б соответствует значению Rh,0. Значение tуменьшается с 50.5 до 2 мин с повышением температуры от 37 до 55 °C.

Показано, что при 55 °C величина Rh,0 не зависит от концентрации белка. Зависимость Rh от времени для тепловой агрегации ГАФД при 55 °C при длительной инкубации подчиняется степенному закону со значением df 1.8, что указывает на выполнение режима агрегации DLCA. Таким образом, данные ДЛС подтверждают механизм агрегации белка, предложенный в данной работе [Khanova et al., 2005; Markossian et al., 2006]. Этот механизм включает стадию формирования стартовых агрегатов, и последующее их слипание. Можно предположить, что механизм агрегации ГАФД, включающий образование стартовых агрегатов, реализуется и в физиологических условиях. Интересно отметить, что при 37 °C стартовые агрегаты появляются уже спустя 50 мин от начала инкубации (рис. 10Б).

Поскольку стабильность белковой молекулы возрастает в условиях краудинга [Chebotareva et I (фототсчет/с) h R (нм) h R (нм) I (фотоотсчет/с) 1.A al., 2004], можно ожидать, что в клетке 0.продолжительность латентной стадии, приводящей к 0.образованию стартовых агрегатов, будет значительно 0.выше.

0.Исходя из данных ДСК, полученных для ГАФД (0.0.40 45 50 55 60 65 мг/мл), были рассчитаны отношения Q/Qt. Зависимость Б интенсивности светорассеяния (I) от температуры были получены в аналогичных условиях. При построении зависимости I от Q/Qt можно проанализировать взаимосвязь между денатурацией и агрегацией фермента.

Рис. 11. Корреляция между тепловой денатурацией и 40 45 50 55 60 65 агрегацией ГАФД (0.5 мг/мл). (A) Зависимость Температура (oC) отношения Q/Qt (Qt – общая теплота денатурации и Q - В теплопоглощение при достижении определенной температуры) от температуры, рассчитанная из данных ДСК. (Б) Зависимость интенсивности светорассеяния при 632.8 нм от температуры для агрегации ГАФД (0.мг/мл) при постоянной скорости нагревания (1 К/мин).

(В) Построение графика зависимости интенсивности светорассеяния от отношения Q/Qt.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.Q/Qt Как видно из рис. 11В, наблюдается строгая корреляция между интенсивностью светорассеяния, характеризующей процесс агрегации, и соотношением Q/Qt, характеризующим долю денатурированного белка. Линейная зависимость интенсивности светорассеяния от соотношения Q/Qt дает предельную величину интенсивности светорассеяния при Q/Qt = 1, которая была бы достигнута при отсутствии преципитации (Ilim = 148000 фотоотсчетов/с).

3.1. Влияние –кристаллина на тепловую денатурацию и агрегацию ГАФД Калориметрическое исследование тепловой денатурации ГАФД в присутствии -кристаллина методом ДСК показало, что положение максимума на кривых ДСК (Tm) смещается в область более низких температур по мере увеличения концентрации -кристаллина. Денатурация ГАФД (0.4 мг/мл), зарегистрированная методом ДСК, характеризуется острым пиком температурного перехода с максимумом при 61.6 °C (рис. 12, кривая 1). При концентрации -кристаллина, равной 0.4 мг/мл, величина Tm снижается до 58.0 °C (рис. 12, кривая 4). Возможно, продукты диссоциации молекулы ГАФД, образующиеся при нагревании белка, взаимодействуют с -кристаллином, что приводит к t Q / Q I (фотоотсчет/с) I (фотоотсчет/с) 3 Рис. 12. Влияние -кристаллина на тепловую денатурацию ГАФД (0.4 мг/мл, 10 мM Na-фосфатный буфер, pH 7.5). Кривые ДСК получены в отсутствие (кривая 1) и в присутствии -кристаллина (кривые 2-4). Использованные концентрации -кристаллина: (1) 0, (2) 0.1, (3) 0.2 и (4) 0.4 мг/мл. Кривая 5 соответствует профилю ДСК -кристаллина (0.4 мг/мл). Нагревание проводилось 0 с постоянной скоростью (1 K/мин).

30 40 50 60 70 уменьшению стабильности ГАФД в присутствии Температура (oC) -кристаллина. Процесс подавления тепловой агрегации ГАФД -кристаллином был изучен методом ДЛС. На рис. 13 показано влияние -кристаллина на кинетику агрегации ГАФД при 45 °C. Расчеты гидродинамического радиуса показывают, что в присутствии -кристаллина формируются агрегаты меньшего размера по сравнению с контролем (рис. 13A-Г; 45 °C).

Анализ зависимости Rh от времени, полученные в присутствии -кристаллина, позволил оценить размер частиц, образующихся в системе в начальный момент времени. Значения 2000 A 300 Б 1600 1200 0 800 0 100 200 300 400 0 200 400 t (мин) t (мин) 400 0 0 100 200 300 400 500 0 200 400 600 t (мин) t (мин) В Г 600 0 200 400 600 800 0 200 400 600 800 1000 t (мин) t (мин) 0 200 400 600 800 0 200 400 600 800 t (мин) t (мин) Рис. 13. Влияние -кристаллина на размер агрегатов, сформировавшихся при нагревании ГАФД (0.4 мг/мл) при 45 °C. Зависимости Rh от времени, полученные в присутствии различных концентраций -кристаллина: (A) 0.025, (Б) 0.05, (В) 0.1 и (Г) 0.4 мг/мл.

Пунктирные линии соответствуют контролю (агрегация в отсутствие -кристаллина).

Вставки показывают начальные участки зависимостей Rh от времени. Сплошные кривые построены согласно уравнению (2).

Теплопоглощение (мкВт) h h R (нм) R (нм) h h R (нм) R (нм) h h R (нм) R (нм) h h R (нм) R (нм) Rh,0, полученные при агрегации ГАФД в присутствии трех концентраций -кристаллина (0.025, 0.05 и 0.1 мг/мл), составляли 9.0–9.3 нм. Такие значения Rh,0 близки к значению Rh,для самого -кристаллина при 45 °C (10.1 ± 0.05 нм). Таким образом, при указанных концентрациях -кристаллина образование стартовых агрегатов, содержащих денатурированные молекулы ГАФД, становится невозможным. В этих условиях денатурированные молекулы ГАФД образуют комплексы с -кристаллином. Начальные участки зависимостей Rh от времени, полученные в присутствии различных концентраций -кристаллина 0.025, 0.05 и 0.1 мг/мл, описываются экспоненциальным уравнением (2).

Аппроксимация начальных участков зависимостей Rh от времени с помощью уравнения (2) показана на вставках рис. 13A-В. Увеличение параметра t2R характеризует снижение скорости агрегации. Так же как и в случае тепловой агрегации L-кристаллина, агрегация ГАФД в присутствии -кристаллина при концентрациях 0.025-0.1 мг/мл, сопровождается расщеплением популяции агрегатов на два компонента при довольно высоких значениях времени (t > tcrit). При более высоких концентрациях -кристаллина распределение агрегатов по размерам остается унимодальным на протяжении всего эксперимента (рис. 13Г).

Тепловую агрегацию ГАФД в присутствии –кристаллина изучали также методом ДЛС в режиме нагревания с постоянной скоростью. Кинетика агрегации исследуемых белков не зависела от режима измерения. Агрегация ГАФД в присутствии -кристаллина приводит к уменьшению размера стартового агрегата. Построение графика зависимости интенсивности светорассеяния от Rh позволило оценить величину стартовых агрегатов (Rh,0) в присутствии различных концентраций –кристаллина при нагревании фермента с постоянной скоростью.

Для агрегации ГАФД в отсутствие –кристаллина значение Rh,0 составляло 22.5 ± 0.8 нм (рис. 14A). С повышением концентрации -кристаллина от 0.1 до 0.4 мг/мл величина Rh,уменьшалась от 19.1 ± 0.2 нм до 13.1 ± 0.2 нм (рис. 14Б-Г).

АБВ Г 40000 400000 Rh,0 = 19 ± 1 нм Rh,0 = 16 ± 1 нм Rh,0 = 22 ± 2 нм Rh,0 = 13.2 ± 0.2 нм 30000 20000 10000 0 0 0 0 40 80 120 0 20 40 60 0 20 40 60 80 8 10 12 14 16 Rh (нм) Rh (нм) Rh (нм) Rh (нм) Рис. 14. Графики зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса, построенные для агрегации ГАФД (0.4 мг/мл), при различных концентрациях -кристаллина: (A) 0, (Б) 0.1, (В) 0.2 и (Г) 0.4 мг/мл.

I (отоотсчет/с) I (отоотсчет/с) I (отоотсчет/с) I (отоотсчет/с) Изучение влияния -кристаллина на кинетику тепловой агрегации ГАФД показало, что подавление агрегации ГАФД в присутствии -кристаллина происходит в результате формирования агрегатов белка меньшего размера. Уменьшение скорости агрегации происходит вследствие включения -кристаллина в состав стартового агрегата. Вероятность слипания стартовых агрегатов, содержащих -кристаллин, меньше единицы. Это обстоятельство объясняет переход кинетического режима агрегации ГАФД от режима DLCA (где зависимость Rh от времени следует степенному закону) к режиму RLCA (где зависимость Rh от времени подчиняется экспоненциальному закону).

4. Тепловая агрегация транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae Тепловую агрегацию ТК изучали методом ДЛС в интервале температур от 30 до 80 °C при постоянной скорости нагревания 1 K/мин. На рис. 14А представлена зависимость интенсивности светорассеяния от температуры для агрегации холоформы ТК, реконструированной из апоформы ТК и кофермента в присутствии ионов магния (кривая 1) или ионов кальция (кривая 2). Агрегация ТК, А - вызванная нагреванием, сопровождалась - увеличением интенсивности светорассеяния.

Прирост интенсивности наблюдался для двух форм холофермента примерно при одинаковых значениях температуры (при T 45 °C). Интенсивность 30 40 50 60 70 светорассеяния при температуре выше 68 °C (для Б Mg2+ магниевой формы фермента) и 75 °C (для кальциевой формы фермента) уменьшалась вследствие преципитации крупных агрегатов.

На рис. 14 Б и В представлены зависимости гидродинамического радиуса от температуры, 30 40 50 60 70 2500 соответственно, для магниевой и кальциевой форм В Ca2+ Рис. 15. Агрегация холоформы ТК (0.2 мг/мл, мМ глицил-глициновый буфер, рН 7,6) в режиме увеличения температуры с постоянной скоростью (1 К/мин). (А) Зависимость интенсивности светорассеяния от температуры для магниевой (кривая 1) и кальциевой форм ТК (кривая 2). (Б, В) Зависимости гидродинамического радиуса от 30 40 50 60 70 температуры: (Б) магниевая и (В) кальциевая Температура (oC) форма ТК.

I (фотоотсчет/с) h R (нм) h R (нм) ТК. В обоих случаях на начальных участках зависимости наблюдается линейный рост агрегатов при увеличении температуры. При высоких значениях температуры, 55 °C для магниевой формы фермента и 60 °C для кальциевой формы, в системе появляются крупные агрегаты, вызванные слипанием исходных частиц (базовых агрегатов).

Построение графика зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса позволило определить размеры стартовых агрегатов. В случае агрегации магниевой формы холофермента ТК, значение Rh,0 составило 47.6 ± 2.5 нм. При агрегации кальциевой формы величина Rh,0 = 33.3 ± 2.3 нм. Возможно, образование более крупных стартовых агрегатов для магниевой формы можно объяснить более низкой ее стабильностью по сравнению с кальциевой формой.

Из полученных данных видно, что агрегация ТК начинается при T 45 °C. По данным ДСК [Esakova et al., 2005] денатурация холофермента ТК начинается при более высоких значениях температуры, 57 – 58 °C, с максимумом теплового перехода 61.8 °C для магниевой формы белка и 64 °C для кальциевой формы. Таким образом, можно предположить, что агрегация ТК опережает денатурацию.

5. Тепловая денатурация и агрегация алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae. Влияние -кристаллина Тепловая денатурация АДГ I была проанализирована методом ДСК. На рис. представлены результаты эксперимента по тепловой денатурации АДГ I в присутствии и в отсутствие -кристаллина. По данным ДСК АДГ I денатурирует необратимо. Кривая теплопоглощения фермента в отсутствие -кристаллина характеризуется наличием 40 50 60 Температура (C) основного пика с максимумом при 63 °C. Профили Рис. 16. Кривые ДСК для АДГ I ДСК, полученные для АДГ I, не зависят от (1.5 мг/мл), полученные в отсутствие (кривая 1) и в присутствия -кристаллина. Это означает, что присутствии -кристаллина (0.-кристаллин не оказывает заметного влияния на мг/мл, кривая 2). Условия эксперимента: 50 мM тепловую денатурацию фермента. Кинетика Na-фосфатный буфер, pH 7.4, тепловой агрегации АДГ I была изучена при 56 °C мM NaCl, скорость нагревания 1 К/мин.

методом ДЛС (рис. 16). На начальных участках Теплопоглощение (мкВт) кинетических кривых при различных концентрациях АДГ A I наблюдается отчетливо выраженный лаг-период.

Зависимость гидродинамического радиуса от времени при различных концентрациях АДГ I (рис. 17А-Д) характеризуется переходом от унимодального 0 50 100 150 200 250 300 Б распределения агрегатов к бимодальному распределению.

Как и в случае агрегации белков (L-кристаллина и ГАФД), начальные участки зависимости интенсивности светорассеяния от Rh линейны (рис. 18). Величина Rh,0 не зависит от концентрации АДГ I и составляет 24 ± 1 нм.

0 50 100 150 Интересно, что начальные участки зависимости Rh от В времени при всех концентрациях АДГ I имеют экспоненциальный характер и описываются уравнением (2), использованным нами для анализа агрегации белков в 0 присутствии -кристаллина. Выполнимость 0 20 40 60 80 Г экспоненциального закона указывает на то, что агрегация АДГ I протекает в кинетическом режиме RLCA (в этом режиме вероятность слипания сталкивающихся частиц меньше единицы). Можно предположить, что молекула АДГ содержит внутримолекулярный шаперон, который 0 20 40 60 блокирует собственную агрегацию белка.

Д Рис. 17. Агрегация АДГ I при 56 °C. Зависимости гидродинамического радиуса (Rh) от времени, полученные при различных концентрациях АДГ I: (A) 0.025, (Б) 0.05, (В) 0.1, (Г) 0.2 и (Д) 0.3 мг/мл. Начальные участки зависимости описаны с помощью уравнения (2).

0 10 20 30 40 50 60 t (мин) Параметры t0 и t2R были рассчитаны с помощью уравнения (2). Величина t0, характеризующая длительность латентного периода (время, за которое происходит формирование стартовых агрегатов), практически не изменяется при увеличении концентрации белка. Параметр t2R, который можно рассматривать как меру скорости агрегации, уменьшается с повышением концентрации АДГ I.

Добавление -кристаллина приводит к подавлению тепловой агрегации АДГ I (0.мг/мл) при 56 °C. Как видно из рисунка 19, в присутствии -кристаллина образуются агрегаты меньшего размера. Экспоненциальная зависимость, описываемая уравнением (2) на h R (нм) h R (нм) h R (нм) h R (нм) h R (нм) 180000 начальных участках Rh от времени (рис. 19Б и - - 2 В), сохраняется. Величина t2R увеличивается с - повышением концентрации -кристаллина, что - - свидетельствует о снижении скорости агрегации АДГ I в присутствии шаперона. В присутствии 0.045 мг/мл -кристаллина процесс тепловой агрегации полностью 0 40 80 120 160 200 подавляется; образуются комплексы Rh (нм) постоянного размера с Rh около 40 нм.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»