WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

связи с тем, что метод ДЛС позволяет Скорость нагревания 1 K/мин.

одновременно регистрировать и изменение интенсивности светорассеяния (I), и значение гидродинамического радиуса (Rh) агрегатов, кинетику агрегации L-кристаллина можно охарактеризовать в следующих координатах:

время, гидродинамический радиус и интенсивность светорассеяния. На рис. 3 представлен график, полученный для агрегации L-кристаллина при концентрации 0.4 мг/мл. При значениях времени выше 63 мин, происходит падение интенсивности светорассеяния (данные не показаны) вследствие преципитации агрегатов крупных размеров. Проекции Теплопоглощение (мкВт) кинетической кривой, на плоскость XY, XZ, и YZ дают зависимости Rh от t, I от t, и I от Rh, соответственно. Особый интерес вызывает проекция на плоскость YZ.

Анализ характера зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса для агрегации белков впервые проведен нами.

График указывает на то, что в момент начального прироста интенсивности Рис. 3. Трехмерный график, демонстрисветорассеяния в системе присутствуют рующий изменение интенсивности довольно крупные частицы, которые мы светорассеяния и гидродинамического радиуса (Rh) во времени на примере агрегации назвали стартовыми агрегатами. Их L-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 °C. Ось X - размер легко определяется по точке время, ось Y - Rh, и ось Z - интенсивность светорассеяния. Проекция графика на пересечения кривой с осью абсцисс. Такой плоскость XY показывает зависимость Rh от анализ был проведен для разных времени, на плоскость XZ – зависимость интенсивности светорассеяния от времени и концентраций L-кристаллина в интервале на плоскость YZ - зависимость интенсивности от 0.025 до 0.4 мг/мл. На рис. 4A светорассеяния от Rh. Кривая на проекции XY рассчитана по уравнению (1).

представлены зависимости I от Rh для указанных концентраций L-кристаллина. Эти зависимости имеют линейные участки для выбранного диапазона значений Rh. Размер стартовых агрегатов Rh,0 остается постоянным и не зависит от концентрации L-кристаллина. Продолжительность латентной стадии (t0), во время которой происходит образование стартовых агрегатов, определили из графика зависимости Rh от времени (рис. 4Б). В начальном интервале времени зависимости Rh от t для всех концентраций L-кристаллина имеют линейный участок. Точка пересечения прямой линии с горизонтальной линией (уровень Rh,0 = 84 нм) соответствует времени латентной стадии (t0). Величина t0 возрастает от 9.5 до 16.7 мин с уменьшением концентрации L-кристаллина от 0.4 до 0.025 мг/мл. Линейное соотношение зависимостей Rh от времени выполняется до определенного значения времени (t). При t > t мин зависимость Rh от времени описывается степенной функцией:

* Rh = Rh[1+ K1(t - t*)]1/ df, (1) A где – R величина Rh при t = t, K1 - константа, df - h фрактальная размерность (структурная 4 характеристика агрегата). Параметр df, полученный Rh,0 = 84 нм для разных концентраций L-кристаллина, приближался к одному значению, равному 1.8. Для режима агрегации «diffusion-limited cluster-cluster 0 200 400 Rh (нм) 800 aggregation» (DLCA), при котором скорость агрегации Б определяется диффузией взаимодействующих частиц, соблюдается универсальная фрактальная размерность 1 (df) - 1.8 [Weitz and Lin, 1986; van Garderen et al., 1994;

Dez-Orrite, 2005;]. Таким образом, можно 0 предположить, что агрегация L-кристаллина 0 10 20 30 40 t (мин) процесс, представляющий взаимодействие Рис. 4. Определение латентной стартовых агрегатов, протекает в режиме DLCA.

стадии тепловой агрегации Это означает, что каждое столкновение частиц L-кристаллина. Зависимости интенсивности светорассеяния от приводит к их слипанию. Иначе говоря, вероятность гидродинамического радиуса (Rh) столкновения частиц равна единице.

(A) и Rh от времени (Б), полученные для разных концентраций Анализ зависимости гидродинамического L-кристаллина: (1) 0.025, (2) 0.05, радиуса (Rh) от времени для агрегации белков дает (3) 0.1, (4) 0.2 и (5) 0.4 мг/мл.

Пунктирная линия на рис. Б важную информацию о механизме агрегации [Ball et соответствует Rh,0 = 84 нм.

al., 1987; Lin et al., 1989; De Spirito et al., 2006]. В данном случае для объяснения механизма агрегации белков мы не можем использовать начальные участки зависимостей Rh от времени, так как полный процесс агрегации включает стадию разворачивания молекулы белка и стадию формирования стартового агрегата.

Экспериментально полученное увеличение интенсивности светорассеяния связано со вторым этапом агрегации, когда происходит слипание стартовых агрегатов и агрегатов более высокого порядка. Мы предполагаем, что область значений, наблюдаемая после завершения линейной зависимости Rh от времени (а именно, при t > t), является наиболее важной для объяснения механизма агрегации. Согласно имеющимся данным, степенная зависимость соблюдается также в кинетике тепловой агрегации гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика и белка оболочки вируса табачной мозаики [Markossian et al., 2006].

I (фотоотсчет/с) h R (нм) А Кинетика агрегации L-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 °C в присутствии -кристаллина представлена на рис. 5. Концентрация -кристаллина варьировала в интервале от 0.025 до 0.8 мг/мл. Согласно данным ДЛС в присутствии -кристаллина наблюдается сложная 0 20 40 60 80 Б динамика изменения размера Rh белковых агрегатов во времени. При низкой концентрации -кристаллина (0.025 мг/мл; рис. 5А) распределение белковых агрегатов по размерам остается унимодальным на 0 20 40 60 80 протяжении всего измерения, а рост агрегатов В значительно замедляется по сравнению с контролем. С увеличением концентрации -кристаллина > 0.05 мг/мл (рис. 5Б-Г) унимодальный рост агрегатов в 0 20 40 60 80 Г Рис. 5. Влияние -кристаллина на кинетику агрегации L-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 °C. Зависимость гидродинамического радиуса (Rh) от времени (Рис. A1500 Г), полученная при различных концентрациях -кристаллина: (A) 0.025, (Б) 0.05, (В) 0.1, (Г) 0.15 и 0 200 400 t (мин) (Д) 0.8 мг/мл. Пунктирные линии соответствуют 0 20 40 60 80 контролю (агрегация L-кристаллина в отсутствие Д -кристаллина). Вставка на рис. Г показывает зависимость Rh от t в растянутом интервале времени.

Кривые 1 и 2 относятся к базовым агрегатам и суперагрегатам, соответственно. Начальные участки зависимости Rh от t (рис. А-В) описываются 0 400 800 t (мин) уравнением (2).

0 20 40 60 80 t (мин) определенный момент времени (при t > 25 мин) переходит в бимодальный и регистрируются два типа частиц. В дополнение к базовым агрегатам (кривая 1) в системе образуются агрегаты более крупного размера - суперагрегаты (кривая 2). Суперагрегаты появляются при t > tcrit. В присутствии двукратного избытка -кристаллина (0.8 мг/мл) расщепления агрегатов на две популяции не происходит и гидродинамический радиус базовых агрегатов при длительной инкубации приближается к предельному значению 18.7 ± 0.1 нм (рис. 5Д). Начальные участки зависимостей Rh от времени, полученные в присутствие различных концентраций -кристаллина в интервале от t = t0 до t = tcrit, описываются уравнением (2) (сплошные линии на рис. 5А-Г):

h R (нм) h R (нм) h R (нм) h h R (нм) R (нм) h h R (нм) R (нм) ln Rh = Rh,0 exp (t - t0) (2) t2R (параметр t2R соответствует интервалу времени, на протяжении которого радиус увеличивается от значения Rh,0 до значения 2Rh,0). Повышение концентрации -кристаллина приводит к уменьшению величины Rh,0 и одновременному увеличению параметров t0 и t2R.

Свободный -кристаллин при этом в системе не обнаруживается. Следовательно, при всех исследуемых концентрациях -кристаллин включается в состав растущих агрегатов.

Уменьшение размера стартовых агрегатов является результатом включения в них -кристаллина. Такие модифицированные стартовые агрегаты проявляют меньшую вероятность к слипанию. Замедление агрегации L-кристаллина в присутствии -кристаллина связано с переходом процесса агрегации из режима «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» в режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation» (RLCA) (режим, при котором вероятность слипания взаимодействующих частиц при их столкновении становится меньше единицы). На основании этого можно заключить, что защитное действие шаперонов заключается в формировании белковых агрегатов меньшего размера.

2.1. Тепловая агрегация УФ-облученного L-кристаллина Кинетика агрегации УФ-облученного L-кристаллина (0.5 мг/мл) при 37 С показана на рис. 6 Начальный участок зависимости гидродинамического радиуса (Rh) от времени описывается экспоненциальным уравнением (2).

А Экспоненциальная зависимость Rh от времени типична для агрегации в режиме RLCA. Анализ зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса показан на рис. 6Б.

Значение Rh,0 при агрегации фотооблученного 0 20 40 t (мин) белка при 37 С составляло 23 ± 4 нм. При Б Рис. 6. Агрегация УФ-облученного L-кристаллина Rh,0 = 23 ± 4.3 нм (0.5 мг/мл) при 37 °C. Зависимость гидродинамического радиуса агрегатов (Rh) от времени (А). Определение размера стартовых агрегатов (Rh,0) для УФ-облученного L-кристаллина при 37 °C (40 мM Na-фосфатный буфер, pH 6.8, 100 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, 3 мM 0 50 100 150 Rh (нм) NaN3) (Б).

h R (нм) I (фотоотсчет/с) столкновении таких стартовых агрегатов вероятность слипания меньше единицы (не каждое столкновение ведет к слипанию). Этот вывод можно сделать только по результатам метода ДЛС. Таким образом, показано, что при фотооблучении L-кристаллина происходит уменьшение его стабильности по сравнению с нативным белком, который в данных условиях не агрегирует. Однако агрегация фотооблученного L-кристаллина в присутствии -кристаллина полностью подавляется при 37 С.

3. Тепловая денатурация и агрегация ГАФД Анализ данных ДСК показал, что тепловая денатурация ГАФД - необратимый процесс.

Кривые теплоемкости ГАФД иллюстрируют четкий тепловой переход (рис. 7). Максимум температурного перехода (Tm) зависит от концентрации белка и увеличивается на 3.5 °C 40 50 60 от 60.7 до 64.2 °C с повышением концентрации Температура (C) белка от 0.5 до 3.0 мг/мл (рис. 7). Такая Рис 7. Температурная зависимость зависимость Tm от концентрации белка избыточной теплоемкости (Cex) ГАФД p характерна для тепловой денатурации (10 мM Na-фосфатный буфер, pH 7.5) при различных концентрациях белка: (1) олигомерных белков и, предположительно, 0.5, (2) 1.5, и (3) 3.0 мг/мл. Значения Cex p указывает на присутствие стадии обратимой получены в расчете на тетрамер ГАФД.

диссоциации до субъединиц, предшествующей Скорость нагревания 1 K/мин.

процессу необратимой денатурации [Kurganov et al., 2000; Sanchez-Ruiz, 1992]. Возможно, в процессе нагревания тетрамер молекулы ГАФД (так называемый "димер димеров") диссоциирует до димеров (и далее, вероятно, до 0.3 мономеров), до того как произойдет их 0.необратимая денатурация.

0.Для того, чтобы получить дополнительное 0.0.доказательство диссоциации ГАФД в 0.150 300 процессе нагревания, мы изучили Мr (кДа) 0.Рис. 8. Седиментационный анализ ГАФД (0.мг/мл; 10 мМ Na-фосфатный буфер, pH 7.5).

(A) Дифференциальное распределение 0.коэффициента седиментации c(s) ГАФД при 0 5 10 15 20 °C. На вставке показано распределение s20, w, S c(M).

--ex p C (кДж моль K ) c ( M ) c ( s ) седиментационное поведение фермента при повышенных температурах. Прежде всего, мы провели седиментационный анализ препарата ГАФД при 20 °C (рис. 8). Нормированное значение коэффициента седиментации для основного пика распределения c(s) составило s20,w = 8.19 ± 0.49 S, что соответствует тетрамерной форме ГАФД. Молекулярная масса тетрамера, полученная из распределения c(M) (см. вставку на рис. 8), равна 165 ± 17 кДа.

Инкубация ГАФД при 45 °C приводит к диссоциации белка (рис. 9). На рис. 9A и Б показано, что при 80 и 90 мин инкубации ГАФД образуются диссоциированные формы фермента со значениями коэффициентов седиментации s20,w = 3.3 S ± 0.1 и 5.40 ± 0.08 S, соответственно.

Следует отметить, что использованный метод 1.A ультрацентрифугирования не позволяет в условиях 0.эксперимента регистрировать олигомерное состояние 0.ГАФД при инкубации менее 80 мин. На графике 0.распределения c(s, f/f0) наблюдаются два пика: основной 0. пик (84% или 79%) с коэффициентом седиментации s20,w Б 1.= 3.3 ± 0.1 S (рис. 9A и Б), соответствующий 0.мономерной форме, и минорный пик (4.3%) с s20,w = 5.± 0.08 S, соответствующий димерной форме ГАФД. В 0.случае, когда ГАФД инкубировали при 45 °C в течение 0.В 3 и 6 часов (рис. 9В и Г, соответственно), происходило 1.исчезновение мономерной формы фермента, что, 0.вероятно, связано с агрегацией нестабильных мономеров. При более длительной инкубации (6 ч) в 0.0. Рис. 9. Диссоциация ГАФД (0.4 мг/мл) при 45 °C.

Г Дифференциальное распределение коэффициента 0.седиментации c(s, f/f0), полученное для прогретого препарата ГАФД при 45 °C в течение 80 мин (A), мин (Б), 3 ч (В) и 6 ч (Г). Измерения, приведены к 0.стандартным условиям и представлены в виде распределения c(s,*). Скорость вращения ротора составляла 30000 об/мин.

0.2 4 6 s20,w, S распределении c(s, f/f0) наблюдался один основной пик (61% или 73%) с коэффициентом s20,w = 4.9 ± 0.2 S, соответствующий димерной форме. При увеличении периода инкубации ГАФД при 45 °С до 14 ч образование агрегатов белка c ( s, *) c ( s, *) c ( s, *) c ( s, *) возрастало. Большие агрегаты ГАФД преципитировали A до достижения ротором максимальной скорости 600000 вращения (40000 об/мин).

400000 Тепловая агрегация ГАФД (0.4 мг/мл) была изучена методом ДЛС в интервале температур от 37 до 55 °C. На рис. 10 приведены зависимости интенсивности 0 20 40 60 80 100 Б 2 светорассеяния и гидродинамического радиуса от времени (A и Б, соответственно), полученные при различных температурах. Рис. 10В показывает 0 20 40 t (мин) зависимости интенсивности светорассеяния от Rh, полученные при разных температурах.

0 20 40 60 80 100 Рис. 10. Кинетика тепловой агрегации ГАФД (0.t (мин) мг/мл) при различных температурах: (1) 37, (2) 45, (3) В 47.5, и (4) 55 °C. Зависимости интенсивности светорассеяния и Rh от времени (A и Б, соответственно).

Вставка на рис. Б показывает начальные участки 20000 зависимости Rh от времени. Горизонтальная линия соответствует значению Rh,0 (Rh,0 = 20 нм). (В) 1 Зависимость интенсивности светорассеяния от Rh.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»