WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Ханова Елена Анатольевна МЕХАНИЗМ ПОДАВЛЕНИЯ АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ -КРИСТАЛЛИНОМ 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2006

Работа выполнена в лаборатории ферментных систем Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант: доктор биологических наук К.А. Маркосян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.П. Юрина кандидат биологических наук Л.В. Белоусова

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов

Защита состоится «19» декабря 2006 г. в 1400 час. на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.

Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «18» ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Неправильный фолдинг и агрегация белков сопровождаются образованием нерастворимых внутриклеточных структур. В связи с тем, что в основе патогенеза значительной части дегенеративных и нейродегенеративных, так называемых «конформационных» заболеваний человека, лежат изменения вторичной и/или третичной структуры белков, приводящие к формированию нерастворимых агрегатов с различной надмолекулярной организацией, изучению агрегации белков уделяется большое внимание.

Проблему агрегации белков приходится учитывать не только в медицине, но и при решении биотехнологических задач, поскольку рекомбинантные белки также часто агрегируют. В физиологических условиях белковые агрегаты не накапливаются в клетках благодаря существованию внутриклеточного механизма «контроля качества» (“quality control”) белков, который осуществляется в результате совместного действия шаперонов и протеиназ.

-Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, являясь представителем семейства малых белков теплового шока, обладает шапероноподобной активностью, способен к образованию устойчивых растворимых комплексов с денатурированными белками и, таким образом, подавляет их агрегацию. В хрусталике -кристаллин обеспечивает защиту - и -кристаллинов от ультрафиолетового облучения и окислительного стресса, повреждающих эти кристаллины и приводящих к развитию катаракты. Образование / и / комплексов в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании его прозрачности и светопреломляющих свойств. Повышенная экспрессия -кристаллина обнаруживается также во многих тканях в условиях стресса и при различных патологиях. В связи с обнаружением того, что -кристаллин in vitro обладает шапероноподобной активностью, появились многочисленные работы по изучению его влияния на денатурацию и агрегацию различных белков и ферментов. Было установлено, что шапероноподобная активность -кристаллина зависит от многих факторов, включая температуру инкубации, скорость нагревания и концентрацию. Показано также, что подавление тепловой агрегации белков -кристаллином является результатом гидрофобных взаимодействий и при повышении температуры шапероноподобная активность -кристаллина возрастает. Тем не менее, несмотря на многочисленные исследования по взаимодействию -кристаллина с белковыми субстратами при нагревании, механизм подавления тепловой агрегации белков -кристаллином остается невыясненным.

Цель работы. Целью настоящей работы является изучение механизма тепловой денатурации и агрегации белков и изучение механизма подавления агрегации белков -кристаллином. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кинетику тепловой агрегации L-кристаллина из хрусталика глаза быка при 60 C и агрегацию УФ-облученного L-кристаллина при 37 C.

2. Изучить кинетику тепловой агрегации глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из мышц кролика.

3. Изучить кинетику тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae.

4. Изучить и провести сравнительный анализ влияния -кристаллина на кинетику тепловой агрегации L-кристаллина, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы I.

5. Исследовать агрегацию магниевой и кальциевой холоформ транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae в процессе нагревания.

Научная новизна. При анализе данных по кинетике агрегации белков, полученных методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) впервые проведено систематическое рассмотрение графиков зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса (Rh). Установлен линейный характер начальных участков этих зависимостей, что обеспечивает простой способ оценки размера стартовых агрегатов. Разработан метод определения длительности лаг-периода, на протяжении которого происходит формирование стартовых агрегатов.

На основании изучения кинетики агрегации белков методом ДЛС сформулирован новый механизм агрегации белков, включающий стадии разворачивания белковой молекулы, формирования стартовых агрегатов и роста фрактального агрегата путем слипания стартовых агрегатов.

Установлен механизм подавления агрегации белков в присутствии -кристаллина.

Показано, что агрегация белков подавляется в результате уменьшения размера стартовых агрегатов. Вероятность слипания при соударении таких частиц становится меньше единицы.

Показано, что анализ зависимости гидродинамического радиуса от времени позволяет выявить белки, которые в развернутом состоянии проявляют шапероноподобную активность и, таким образом, защищают себя от агрегации. Примером может служить алкогольдегидрогеназа I из Saccharomyces cerevisiae.

Результаты, полученные методами ДЛС и ДСК при нагревании ГАФД с постоянной скоростью, позволили установить корреляцию между тепловой агрегацией и денатурацией белков (ГАФД). Методом седиментационного анализа показана диссоциация тетрамерного фермента ГАФД при повышенных температурах.

Практическое значение работы. Понимание процессов формирования белковых агрегатов в клетке открывает новые перспективы в исследовании и лечении так называемых “конформационных” заболеваний. Исследование шапероноподобной активности -кристаллина может способствовать выяснению его разнообразных функций в различных тканях в норме, в условиях стресса и при различных патологических нарушениях.

Результаты исследований механизма агрегации белков и механизма шапероноподобной активности -кристаллина можно использовать в работах по поиску химических агентов, которые блокируют агрегацию и модулируют защитное действие -кристаллина.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XVII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), ХII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), на конкурсе аспирантов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН на соискание стипендии имени члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича (2006). Присуждена стипендия имени члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича (2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 182 страницах, содержит 79 рисунков и 13 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (8 глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы (328 источников).

Сокращения, принятые в тексте. АДГ – алкогольдегидрогеназа; ГАФД - глицеральдегид3-фосфат-дегидрогеназа; ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние; ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия; ДСН – додецилсульфат натрия; ПААГ – полиакриламидный гель; ТК – транскетолаза; DLCA - diffusion-limited cluster-cluster aggregation; RLCA - reaction-limited cluster-cluster aggregation.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Кристаллины (- и L-) выделяли из хрусталиков глаза быка согласно методике, описанной ранее [Chiou et al., 1979] совместно с к.б.н. К.О. Мурановым (лаборатория физико-химических основ рецепции, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН). Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа из мышц кролика была любезно предоставлена к.б.н. Р.А. Асриянц (отдел биохимии животной клетки НИИ физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ). Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae была любезно предоставлена к.б.н. О.Н. Соловьевой (отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ). Лиофилизованный препарат дрожжевой АДГ I («Sigma», США), содержащий, по данным ДСК, примесь термолабильной формы фермента, прогревали при 52 °C в течение 13 мин. При повторном сканировании прогретого образца на кривой теплопоглощения ДСК получали один пик.

Степень чистоты белков, используемых в работе, анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН.

Калориметрические исследования проводили совместно с к.б.н. С.Ю. Клейменовым (лаборатория молекулярной организации биологических структур, Институт биохимии им.

А.Н. Баха РАН) на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре «ДАСМ-4М» (ИБП РАН) при постоянном избыточном давлении 2.2 атм, со скоростью нагревания 1 К/мин. Обратимость теплового перехода проверяли путем сравнения остаточной теплоемкости при повторном прогреве образца.

Кинетику агрегации белков изучали методом ДЛС. Измерения проводили на установке Photocor Complex (Photocor Instruments Inc., США) с He-Ne лазером (Coherent, USA, Model 31-2082, 632,8 нм, 10 мВ) в качестве источника света. Температура образцов поддерживалась при помощи PID temperature controller в пределах ± 0.1 °C. Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов и логарифмической шкалой времени. Обработку автокорреляционных функций и расчёт размеров гидродинамического радиуса Rh проводили при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль).

Эксперименты по скоростной седиментации выполняли совместно с д.б.н. Н.А.

Чеботаревой (лаборатория молекулярной организации биологических структур, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН) на аналитической ультрацентрифуге «Spinco E» (Beckman, США), с использованием абсорбционной сканирующей оптической системы при длине волны 280 нм, при 20-45 °С и скоростях вращения ротора от 1000 до 40000 об/мин.

Коэффициенты седиментации определяли с использованием программы SEDFIT [Schuck, 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование стабильности –кристаллина в процессе нагревания Все эксперименты по испытанию шапероноподобной активности –кристаллина проводили при относительно высоких значениях температуры. В связи с этим предварительно было изучено олигомерное состояние –кристаллина при повышенных температурах. Изменение олигомерного состояния -кристаллина при нагревании регистрировали методом ДЛС. В физиологических условиях -кристаллин является высокомолекулярным комплексом (825 кДа) с размером гидродинамического радиуса 10.нм. На рис. 1A и Б показана зависимость интенсивности светорассеяния (I) и гидродинамического радиуса (Rh) –кристаллина от температуры в интервале от 24 до 76 °C.

Нагревание проводили с постоянной скоростью 1 K/мин. Увеличение температуры приводило к небольшому уменьшению интенсивности светорассеяния (кривая 1, рис. 1A) и одновременному уменьшению величины Rh (кривая 1, рис. 1Б), связанному с диссоциацией А –кристаллина до олигомерных форм меньшего размера. Rh достигает минимального значения (Rh,min = 8.7 нм) при температуре 54 °C. Дальнейшее повышение 20000 температуры до 76 °C приводит к увеличению размера Rh до 13.8 нм, что указывает на агрегацию диссоциированных форм -кристаллина. Охлаждение 30 40 50 60 -кристаллина (кривая 2, рис. 1А и Б) сопровождалось Б небольшим увеличением интенсивности Рис. 1. Денатурация и агрегация -кристаллина при нагревании со скоростью 1 К/мин. Интенсивность светорассеяния (A) и гидродинамический радиус (Б) -кристаллина (1 мг/мл; 40 мM Na-фосфатный буфер, pH 6.8, 100 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, и 3 мM NaN3) представлены как функции от температуры. Кривая 30 40 50 60 В на рис. A и Б соответствует нагреванию с постоянной 2 скоростью (1 K/мин), кривая 2 – охлаждению от 76 до 26 °C в течение 80 мин. (В) Зависимость удельной теплоемкости (Cex) от температуры для исходного p препарата -кристаллина (1 мг/мл; 40 мM Na-фосфатный буфер, pH 6.8, 100 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, и 3 мM NaN3; кривая 1). Кривая 2 на рис. В соответствует повторному нагреванию -кристаллина 30 40 50 60 сразу после его охлаждения.

Температура (oC) I (фотоотсчет/с) h R (нм) --ex p C (кДж моль K ) светорассеяния и увеличением Rh до 15 нм. Данные по ДСК для -кристаллина показали, что белок начинает денатурировать при температуре выше 48 °C (кривая 1, рис. 3В). Удельная теплоемкость (Cex) достигала максимальной величины при T = 63.7 °C. Повторное p нагревание образца сразу после его охлаждения (кривая 2 на рис. 1В) показало, что процесс денатурации –кристаллина обратим на 86%. Таким образом, -кристаллин обладает самовосстанавливающейся структурой, а присутствие остаточных агрегатов в системе после охлаждения (см. рис. 1A и Б) связано с частичной необратимостью его денатурации.

-Кристаллин стабилен при длительном нагревании и при повышении температуры образуется более динамичная структура белка.

2. Тепловая денатурация и агрегация L-кристаллина в отсутствие и в присутствии -кристаллина Калориметрияческие исследования показали, что L-кристаллин денатурирует необратимо.

Кривая теплоемкости для L-кристаллина имеет основной пик с температурным максимумом в области 62.5 C и небольшое плечо при 68 C (рис. 2, кривая 1). Присутствие -кристаллина не влияет на процесс денатурации L-кристаллина (рис. 2, кривая 3).

30 40 50 60 70 Согласно данным ДЛС, при агрегации Температура (oC) L-кристаллина при 60 C распределение Рис. 2. Кривые ДСК для L-кристаллина агрегатов по гидродинамическому радиусу (Rh) (1.5 мг/мл) (кривая 1) и -кристаллина (1.2 мг/мл) (кривая 2) и их смеси (кривая остается мономодальным до момента 3). Условия эксперимента: 40 мM преципитации крупных агрегатов (рис. 3). В Na-фосфатный буфер, pH 6.8, 100 мM NaCl, 1 мM ЭДТА, и 3 мM NaN3.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»