WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

ВЛИЯНИЕ ЭПИБРАССИНОЛИДА И АМБИОЛА НА ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС И УЛЬТРАСТРУКТУРУ ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ РЕГУЛЯЦИИ РОСТОВЫХ ПРОЦЕССОВ В ОНТОГЕНЕЗЕ Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006 2

Работа выполнена в лаборатории биохимии фитоиммунитета Института биохимии им. А.Н.

Баха РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Н.П. Кораблева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е.Б. Кириченко кандидат биологических наук, И.И. Чернядьев

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится «18» апреля 2006 года в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т, 33, корп. 1.

Автореферат разослан «16 » марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 3 Актуальность проблемы. Выяснение механизмов регуляции ростовых процессов в связи с устойчивостью растений к стрессовым воздействиям является важной проблемой биологии.

Актуальным направлением работ в этой области представляется изучение сигнальных молекул, в том числе стрессовых фитогормонов и их синтетических аналогов, контролирующих рост и устойчивость растений картофеля. В основе исследований лежит концепция о взаимосвязи стадий онтогенеза с устойчивостью. Например, формирование реакций иммунитета сопряжено с длительностью генетически закрепленного признака глубокого покоя у клубней картофеля различных сортов.

Одним из перспективных подходов к решению задач, связанных с повышением продуктивности картофеля, является скрининг физиологически активных соединений нового поколения, обладающих свойствами регуляторов роста и иммуномодуляторов. Основные биологические параметры отбора такого рода соединений - их влияние на покой и ростовые процессы после его окончания. Ранее были выявлены две группы веществ – брассиностероиды и антиоксиданты, способные регулировать рост и устойчивость растений к неблагоприятным факторам. Изучение влияния представителей этих групп – эпибрассинолида и амбиола на картофель важно для понимания механизма их действия и определения наиболее эффективных путей разработки технологии применения.

Получение сведений об изменениях в гормональном балансе, морфогенезе и ультраструктуре тканей точек роста позволяет выяснить взаимодействие физиологически активных соединений с функционированием сигнальных систем, включающих стрессовые фитогормоны (этилен, абсцизовая кислота) и выявить зоны апикальных меристем, воспринимающие регуляторные сигналы.

Особый интерес для изучения представляют генетически модифицированные (трансгенные) растения картофеля, обладающие защитными свойствами против фитопатогенов. Исследование морфогенеза и тонкой структуры клеток отдельных органов исходных и трансгенных растений необходимо для определения посттранскрипционных изменений в ответных реакциях на действие физиологически активных веществ и оптимизации путей их использования в биотехнологии.

Цель работы и задачи исследования. Цель работы – исследование механизма действия эпибрассинолида и амбиола при регуляции покоя и роста растений картофеля путем выявления изменений в гормональном балансе, морфогенезе и ультраструктуре клеток апикальных меристем.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Изучить действие эпибрассинолида и амбиола на покой и рост растений картофеля;

2) Определить содержание фитогормонов (этилен, абсцизовая кислота, -индолилуксусная кислота, цитокинины) в отдельных органах растений картофеля на разных стадиях онтогенеза и под действием эпибрассинолида и амбиола;

3) Изучить влияние эпибрассинолида на отдельные клеточные параметры тканей апикальных меристем клубней картофеля;

4) Исследовать действие амбиола на формирование морфогенетических признаков у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля;

5) Изучить влияние амбиола на пластидный аппарат клеток апикальных меристем клубней исходных и трансгенных растений картофеля.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование структурно-функциональных и гормональных изменений в тканях исходных и трансформированных по гену дефензина (трансгенных) растений картофеля под действием эпибрассинолида и амбиола, регулирующих ростовые процессы на разных стадиях онтогенеза.

Установлено, что эпибрассинолид в рост-ингибирующих концентрациях пролонгирует состояние глубокого покоя путем изменения гормонального баланса в тканях апикальных меристем – увеличения образования этилена и абсцизовой кислоты. Показано, что клеткамимишенями, воспринимающими регуляторные сигналы этилена и абсцизовой кислоты, являются клетки стержневой меристемы апексов, способность которых к растяжению определяет переход от покоя к росту.

Установлено, что регуляция ростовых процессов в растениях картофеля под действием амбиола определяется его влиянием на содержание фитогормонов и изменением соотношения ауксины+цитокинины/абсцизовая кислота.

Амбиол изменяет морфогенетические признаки у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля, регулирует формирование стебля, образование листьев и корней. Установлены различия в ответных реакциях на амбиол пластидного аппарата клеток исходных и трансгенных растений. Амбиол стимулирует дифференцировку внутренней мембранной системы пластид, в том числе, интенсивное формирование трубчатого мембранного комплекса в пластидах клеток апикальных меристем.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные сведения о механизме действия эпибрассинолида и амбиола расширяют представления о регуляции ростовых процессов в растениях картофеля на разных стадиях онтогенеза и могут быть использованы для разработки новых биотехнологий повышения продуктивности картофеля и его устойчивости к стрессовым воздействиям.

Изменение гормонального баланса - один из важных показателей при скрининге физиологически активных веществ, регулирующих покой и рост. Повышение содержания стрессовых фитогормонов (этилена и абсцизовой кислоты) может служить биохимическим тестом пролонгирования глубокого покоя, стадии онтогенеза, во время которой растения обладают комплексной устойчивостью к болезням, неблагоприятным условиям температуры и влажности.

В качестве ещё одного теста изменения стадии онтогенеза предлагается определение способности к растяжению клеток-мишеней (клеток стержневой меристемы апексов), воспринимающих регуляторные сигналы.

Результаты анализа посттранскрипционных изменений в тканях трансформированных по гену дефензина растений позволяют наметить пути использования физиологически активных веществ как для коррекции выявленных отклонений в росте и развитии, так и для усиления положительных эффектов трансформации.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на: International Symposium “Signalling Systems of Plant Cells” (Moscow, Russia, 2001); VI Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва, 2001);

17th International Conference on Plant Growth Substances (Brno, Czech Republic, 2001); VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002); III Съезде Всероссийского биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); V съезде Общества физиологов растений (Пенза, 2003); II International Congress «Biotechnology: state of the art and prospects of development» (Moscow, Russia, 2003); ХI съезде Русского ботанического общества (Новосибирск-Барнаул, 2003); IV Международной научной конференции «Регуляторы роста, развития и продуктивности растений» (Беларусь, Минск, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ (9 статей и 7 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на 115 страницах машинописного текста и содержит 21 рисунок, 9 таблиц и 27 электронно-микроскопических фотографий. Библиография включает в себя 250 названий отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования - растения картофеля Solanum tuberosum L., на разных стадиях онтогенеза. В опытах использовали: 1) клубни картофеля, 2) точки роста (апикальные меристемы - апексы) клубней картофеля, 3) отдельные органы растений, выращенных в полевых условиях, 4) растения-регенеранты, полученные in vitro на искусственных питательных средах.

Опыты проводили на нескольких сортах картофеля – Невский, Скороплодный, Бронницкий (меристемный) и Дезире (исходные и трансгенные растения). Трансформация картофеля с. Дезире по гену антимикробных пептидов - дефензинов из амаранта Amaranthus caudatus L. была проведена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН [Ляпкова и др., 2001].

Использованные физиологически активные вещества:

– эпибрассинолид (22R, 23R,24R)-2,3,22, 23-тетраокси-В-гомо-7-окса-5-эргостан-6ОН), синтезированный в Институте биоорганической химии АНБ, Минск [Хрипач, 1993];

– амбиол (дигидрохлорид-2-метил-4-диметиламинометил-5-гидроксибензимидазола), синтезированный в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН [Смирнов и др., 1984].

Изучение влияния физиологически активных веществ на ростовые процессы в апикальных меристемах. Клубни картофеля сорта Бронницкий обрабатывали растворами эпибрассинолида в концентрации 10-5 - 5 мг/л, сорта Невский – в концентрации 10-4 -10-мг/л; сортов Невский и Дезире - растворами амбиола (концентрации 1-60 мг/л). Из контрольных и опытных клубней в разное время после обработки изолировали точки роста (апексы) для оценки интенсивности прорастания.

Интенсивность выделения этилена клубнями определяли методом газовой хроматографии [Ward, 1978; Ракитин, Ракитин, 1986], на хроматографе (Цвет, Газохром, Россия), оборудованном колонкой Порапак N 3000х2 мм (несущий газ гелий 23 см3 /мин-1), при температуре камеры, инжектора и пламенно-ионизационного детектора 80, 100 и 150°С.

соответственно.

Содержание абсцизовой кислоты методом ГЖХ [Milborrow, 1970; Сухова и др., 1987] определяли в очищенном метаноловом экстракте на газовом хроматографе (Цвет, Газохром, Россия), с пламенно-ионизационным детектором и колонкой ОV-1, (несущий газ азот, 30 см/мин-1). Содержание связанной абсцизовой кислоты определяли после щелочного гидролиза экстракта с 10%-ой NаоН в течение 1 часа при 60°С.

Содержание -индолилуксусной кислоты, абсцизовой кислоты и цитокининов (зеатин+зеатин-рибозид) в тканях растений картофеля определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [Веселов, Кудоярова, 1990]. Пробы для анализов отбирали в фазу цветения растений (листья) и после уборки урожая (клубни). Растительный материал фиксировали жидким азотом, высушивали в термостате при 55-600С. Экстракцию изученных групп фитогормонов проводили из одной навески (от 250 до 500 мг сухой массы) комплексным методом [Власов и др., 1979].

Вегетационные и полевые опыты проводили на базе агробиостанции Орловского государственного университета, в типовом вегетационном домике и на опытном поле (площадь учетной делянки – 160 м2). Картофель выращивали стандартным методом в соответствии с общепринятой агротехникой.

Для изучения влияния амбиола на рост и продуктивность картофеля растения в фазе бутонизации опрыскивали раствором препарата в концентрации 30 мг/л, из расчета 100 мл на одно растение. Контрольные растения опрыскивали водой.

Продуктивность картофеля в почвенной культуре определяли взвешиванием клубней в сосудах (9 биологических повторностей), в полевом опыте – путем пробных копок (каждый 5-ый куст по диагонали делянки, всего 50 кустов), урожайность рассчитывали в ц/га.

Культивирование растений in vitro. Стебли эксплантов исходных и трансгенных растений картофеля с. Дезире разрезали на несколько равных частей размером около 1 см (для каждого варианта опыта и контроля) и высаживали в стерильные пробирки с 20 мл регенерационной среды Мурасиге-Скуга [Murashige, Skoog, 1962]. Для изучения влияния амбиола на рост регенерантов препарат добавляли в среду для выращивания до получения в ней конечных концентраций амбиола 5, 20, 40 и 60 мг/л. Закрытые пробирки помещали в климокамеру с фотопериодом 16 ч и температурой 21оС.

Морфолого-ботанический анализ. У регенерантов, культивируемых в климокамере, измеряли длину образовавшихся корней (на 7 сутки). На 21 сутки измеряли высоту растения, подсчитывали количество листьев; корни и листья отделяли и взвешивали.

Электронная микроскопия. Электронно-микроскопическое исследование проводили по общепринятой методике. Апексы фиксировали в 2,5%-ном глутаровом альдегиде, приготовленном на 0,1 М (Nа-К) фосфатном буфере, рН 7,1-7,2, дофиксировали в 1%-ном растворе ОsО4, обезвоживали в серии спиртов возрастающей крепости и ацетоне и заключали в эпоксидную смолу ЭПОН-812 [Luft, 1961]. Для сравнительного ультраструктурного изучения брали клетки из различных зон апикальных меристем.

Предварительную ориентировку срезов для определения зональности апексов выполняли с помощью полутонких срезов под световым микроскопом. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме "LКВ-3" (Швеция) контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу [Reynolds, 1963] и просматривали под электронным микроскопом "JEМ-100С" (Япония).

Морфометрическую обработку электронно-микроскопических изображений проводили по методу Аветисова-Стефанова (1979), а также с помощью компьютерной программы «Cell Counter», специально разработанной для измерения площадей клеток и различных внутриклеточных структур по отсканированным изображениям, полученным с электронного микроскопа [Платонова и др., 2005].

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы «Microsoft Excel». Результаты измерений, выраженные средними арифметическими показателями и их стандартными ошибками, представлены в таблицах и графиках.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»