WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Полученные данные демонстрируют значительное ускорение агрегации модельных белковых субстратов и увеличение предельного значения кажущегося поглощения при 360 нм в присутствии MIF.

Для выявления влияния MIF на процесс агрегации белков при температурах, близких к физиологичекому уровню, была проведена серия экспериментов по исследованию кинетики агрегации белков при 41,5оС в отсутствие или в присутствии MIF. На примере агрегации ADH (Рис. 13) было также продемонстрировано ускорение агрегации в присутствии MIF при субстехиометрическом молярном соотношении MIF : ADH (0,6 : 1).

AРис. 13. Кинетические кривые агрегации ADH 0,(130 мкг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии MIF в концентрации 24 мкг/мл (2) 0,при 41,5oC в 20 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0.

0, 0, 0,2 4 6 8 10 12 14 Время, мин В данном эксперименте, характеризующемся более мягкими денатурирующими условиями, агрегаты в осадках оказались легко растворимыми в Tris-HCl буфере, не содержащем мочевины.

Анализ нативного электрофореза в ПААГ проб ADH, инкубированных при 41,5оС в отсутствие или в присутствии MIF в течение 20 минут (Рис. 14), показал, что супернатант содержит димер и тетрамер ADH (кажущиеся молекулярные массы 80 и 160 кДа соответственно), причем в присутствии MIF (дорожка 3) содержание этих олигомеров меньше, чем в его отсутствие (дорожка 1).

В растворенном осадке в отсутствие MIF наблюдаются слабо выраженное пятно, соответствующее тетрамеру ADH, и высокомолекулярные олигомеры, едва проникающие в гель (дорожка 2). В присутствии MIF (дорожка 4) в осадке обнаруживаются довольно яркие полосы, которые могут соответствовать димеру и тетрамеру ADH, а также высокомолекулярные олигомеры и полоса MIF (кажущаяся молекулярная масса 12 кДа), что свидетельствует об образовании гетероолигомеров, содержащих как ADH, так и MIF.

1 2 3 Рис. 14. Электрофорез в неденатурирующих условиях 134 проб после окончания процесса агрегации ADH.

Супернатанты, полученные в результате центрифугирования при 10 000 g в течение 20 минут суспензий ADH после инкубации при 41,5oC в 20 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0, в отсутствие (дорожка 1), или в присутствии 24 мкг/мл MIF (дорожка 3); осадки тех же проб в отсутствие (дорожка 2), или в присутствии мкг/мл MIF (дорожка 4); маркеры молекулярных масс (дорожка 5).

В этом случае высокомолекулярные олигомеры располагаются в области более низких молекулярных масс (дорожка 4) по сравнению с пробой, не содержащей MIF (дорожка 2).

На основании анализа результатов последнего эксперимента можно сделать важный вывод о том, что при тепловом стрессе в диапазоне температур, близких к физиологическим, несмотря на ускорение агрегации субстратных белков в присутствии MIF, образующиеся агрегаты оказываются легко растворимыми. Это может означать, что после снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка к нативному состоянию. В этом смысле в начале развития процесса агрегации MIF обратимо связывается с частично денатурированным белком, стабилизируя его структуру и, возможно, концентрирует субстрат в агрегированном состоянии. Однако, в конечном итоге, в случае снятия теплового стресса и возврата системы к нормальному состоянию, MIF может играть шапероноподобную роль.

Была исследована активность ADH в супернатантах и осадках, солюбилизированных в 20 мМ Tris-HCl буфере, pH 6,8, а также определено содержание белка в этих фракциях. Падение активности ADH в супернатантах после агрегации коррелировало со снижением в них содержания белка.

Анализ кинетических кривых показал высокую степень кооперативности процесса агрегации лабильных белковых субстратов в присутствии MIF.

Особенно ярко это проявляется при агрегации ADH при температуре, близкой к физиологическому уровню (Рис. 13). Сигмоидная кривая агрегации в сравнительно коротком промежутке времени (около 15 минут) демонстрирует возрастание величины Аlim в ~10 раз под действием MIF в субстехиометрическом диапазоне концентраций.

Некоторые известные шапероны, в частности протеиндисульфидизомераза и триггер-фактор (пептидил-пролил-цис-транс изомераза), являющиеся катализаторами фолдинга, а также HSP47 при определенных условиях ускоряют агрегацию субстратных белков.

Для решения вопроса о том, как MIF может функционировать в многокомпонентной шаперонной сети совместно с другими шаперонами требуются дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ 1. Разработан новый оригинальный метод выделения фактора ингибирования миграции макрофагов из мозга быка, основанный, главным образом, на эксклюзионной хроматографии на полимере TSK Toyopearl HW-55.

2. Показано, что фактор ингибирования миграции макрофагов представляет собой смесь гомоолигомерных форм с кажущимися молекулярными массами 12, 48, 60, 120, 168 и 480 кДа.

3. Обнаружено, что фактор ингибирования миграции макрофагов обладает шапероноподобными свойствами, проявляющимися в способности тормозить тепловую агрегацию модельных белковых субстратов (гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика и малатдегидрогеназы из сердца свиньи) в диапазоне температур 40–42оС и различных концентрациях белков.

4. Продемонстрировано защитное действие фактора ингибирования миграции макрофагов в процессе термоинактивации частично денатурированных малатдегидрогеназы и гликогенфосфорилазы b, проявляющееся как в торможении падения ферментативной активности при тепловом воздействии, так и в ускорении реактивации ферментов после снятия теплового стресса.

5. Показано образование гетероагрегатов, содержащих белковый субстрат и фактор ингибирования миграции макрофагов. Фактор ингибирования миграции макрофагов проявляет шаперонную активность в форме мономера.

6. На примерах агрегации гликогенфосфорилазы b при 48оС и алкогольдегидрогеназы в диапазоне температур 40–44оС обнаружено значительное ускорение агрегации белков в присутствии фактора ингибирования миграции макрофагов. При температурах, близких к физиологическому уровню, наблюдается стабилизация олигомерной структуры субстрата, торможение роста агрегатов и повышение их растворимости, что может способствовать ренатурации белка к нативному состоянию после снятия денатурирующего воздействия.

7. Выявленные свойства стресс-индуцируемого белка, фактора ингибирования миграции макрофагов, могут свидетельствовать о его защитной роли в условиях теплового стресса.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Статьи 1. Cherepkova O.A., Gurvits B.Ya. (2004) Macrophage migration inhibitory factor (MIF): identification of the 30 kDa MIF–related protein in bovine brain.

Neurochem. Research. V. 29. No. 7. P. 1391-1396.

2. Cherepkova O.A., Lyutova E.M., Gurvits B.Ya. (2005) Charge Heterogeneity of Bovine Brain Macrophage Migration Inhibitory Factor.

Neurochem. Research. V. 30. No. 1. P. 151-158.

3. Черепкова О.А., Лютова Е.М., Гурвиц Б.Я. (2006) Фактор ингибирования миграции макрофагов; выделение из мозга быка.

Биохимия. Т. 71. № 1. С. 90-96.

4. Cherepkova O.A., Lyutova E.M., Eronina T.B., Gurvits B.Ya. (2006) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor. Intern. J.

Biochem. Cell Biol. V. 38. No. 1. P. 43-55.

5. Черепкова О.А., Лютова Е.М., Еронина Т.Б., Гурвиц Б.Я. (2006) Ускорение агрегации белков в условиях теплового стресса под влиянием фактора ингибирования миграции макрофагов. Биохимия. Т. 71. № 2. С.

182-189.

Тезисы.

1. Черепкова О.А., Гурвиц Б.Я. (2003) Выделение и изучение свойств термостабильного белка мозга – фактора ингибирования миграции макрофагов. 7-ая Пущинская школа – конференция молодых ученых “Биология – наука ХХI века”. Тез. докл. C. 389.

2. Gurvits B.Ya., Cherepkova O.A., Klesov R.V. (2003) The brain pool of immunologically active heat-stable proteins in relation to adaptation to heatshock and other kinds of stress. J. Neurochem. V. 87. Suppl. 1. P. 152. P15-03.

3. Gurvits B.Ya., Cherepkova O.A., Eronina T.B. (2003) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor from bovine brain. J.

Neurochem. V. 88. Suppl. 1. P. 60. P23-4.

4. Черепкова О.А., Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А., Гурвиц Б.Я. (2004) Термостабильный белок мозга (фактор ингибирования миграции макрофагов) в роли шаперона. III съезд биофизиков. Тез. докл. С. 122-123.

I. 106.

5. Черепкова О.А, Лютова Е.М., Еронина Т.Б., Гурвиц Б.Я. (2005) Иммунологически активный белок – фактор ингибирования миграции макрофагов; шаперонная и антишаперонная активности. Международный симпозиум “Молекулярные механизмы регуляции функции клетки”.

Сборник тезисов. Тюмень. С. 5.

6. Gurvits B.Ya., Cherepkova O.A., Lyutova E.M., Eronina T.B. (2005) The macrophage migration inhibitory factor exhibits chaperone and anti-chaperone activities. FEBS J. V. 272. Suppl. 1. P. 353.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»