WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

При повышении температуры до 52 – 60оС его активность резко падает, однако, методом кругового дихроизма было показано, что при этих условиях MIF сохраняет целостность своей вторичной структуры (данные не приведены).

A/Ao A/Ao А Б 1,1, 37oC 1,37oC 42oC 1, 0,45oC 0, 0, 0,45oC 0,52oC 0, 0,2 52oC 0, 60oC 60oC 0,0 0,10 20 30 40 10 20 30 40 50 Время, мин Время, мин Рис. 3. Таутомеразная активность MIF в отсутствие (А) и в присутствии (Б) 2 мМ -МЕ при различных температурах. По оси абсцисс отложено время инкубации, по оси ординат – отношение кажущегося оптического поглощения при 330 нм при повышенной температуре (А) к значению А при 25оС (Ао).

На основании анализа структурно-функциональных свойств стрессиндуцируемого белка, MIF, было предположено, что он может проявлять шапероноподобные свойства в условиях теплового стресса.

Шапероноподобная активность. Использовали тест–систему, основанную на подавлении тепловой агрегации модельных белковых субстратов: MDH и Ph b. Агрегация белков в присутствии MIF снижалась по мере увеличения его концентрации (Рис. 4).

MIF проявляет значительный эффект даже при субстехиометрических концентрациях (Рис. 4 А, кривая 2, соотношение MIF : MDH составляет 0,2 : 1).

Полное торможение агрегации MDH наблюдалось при соотношении MIF :

MDH – 1 : 1 (Рис. 4 А, кривая 5), а в случае Ph b – при молярном соотношении MIF : Ph b – 2 : 1 (Рис. 4 Б, кривая 4). Было показано, что торможение агрегации MDH также наблюдается при добавлении в среду 2 мМ -МЕ (данные не представлены). Это свидетельствует о том, что действие MIF на агрегацию субстрата не опосредовано образованием S-S-связей.

При использовании в аналогичных условиях бычьего сывороточного альбумина вместо MIF, эффект торможения агрегации не наблюдался (Рис.

4 В).

Добавление MIF в конечной концентрации 10 мкг/мл через 12 минут после начала агрегации MDH приводило к ее полному торможению (Рис. 4 Г, кривая 3). Полученные результаты показывают, что MIF может связываться с частично развернутой молекулой субстрата. Эта способность присуща многим шаперонам.

Для более детального выявления молекулярного механизма действия MIF пробы центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут и исследовали состояния агрегатов в осадках и супернатантах.

Осадки, растворенные в 4 М мочевине (в случае Ph b), или в 20 мМ TrisHCl буфере, рН 7,0 (в случае MDH), подвергали электрофорезу в присутствии Ds-Na (Рис. 5 А).

A A 360 0, A Б 0, 0, 2 0, 0,0, 0,0, 0, 0, 20 40 60 80 5 10 15 20 25 Время, мин Время, мин A A 360 0, 0, В Г MIF 1, 0, 0, 0, 0, 0,00 0, 5 10 15 20 25 30 5 10 15 20 25 Время, мин Время, мин Рис. 4. Кинетика тепловой агрегации белковых субстратов. А. Агрегация MDH (26 мкг/мл) при 40оС в 20 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) и в присутствии MIF в концентрациях 1,5 мкг/мл (2), 3 мкг/мл (3), 6 мкг/мл (4) и 10 мкг/мл (5). А360 – кажущееся оптическое поглощение при 360 нм. Б. Агрегация Ph b (130 мкг/мл) при 42оС в 80 мМ Hepes буфере, рН 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА, в отсутствие (1) и в присутствии MIF в концентрациях 1,8 мкг/мл (2), 25,2 мкг/мл (3) и 34 мкг/мл (4). В. Агрегация MDH (26 мкг/мл) в отсутствие (1) и в присутствии бычьего сывороточного альбумина в концентрациях мкг/мл (2) и 20 мкг/мл (3). Г. Агрегация MDH (26 мкг/мл) в отсутствие MIF (1), измеренная в трех различных кюветах при 40оС в 20 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0. Через 12 минут после начала агрегации был добавлен MIF в конечных концентрациях 3 мкг/мл (2) и 10 мкг/мл (3).

Анализ электрофореграмм показал, что по мере увеличения концентрации MIF количество белка в осадках уменьшается, что согласуется с кривыми агрегации. Это свидетельствует о том, что MIF обладает шапероноподобными свойствами. В случае Ph b на конечной стадии агрегации наблюдается образование гетероагрегатов: Ph b и комплекса Ph b с MIF (Рис. 5 А). Последнее наблюдалось и для MDH в случае больших концентраций MIF (данные не показаны).

При нативном электрофорезе солюбилизированного осадка MDH, полученного на конечной стадии тепловой агрегации, в отсутствие MIF (Рис. Б, дорожка 1) обнаружена одна полоса с кажущейся молекулярной массой кДа. Это свидетельствует о том, что MDH во время агрегации не распадается на мономеры, а агрегирует в виде димера. С помощью электрофореза в неденатурирующих условиях осадка MDH, полученного после агрегации в присутствии MIF и растворенного в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,0, показано, что MDH остается также в виде димера, но интенсивность пятен на электрофореграммах, соответствующих кривой агрегации 2 (Рис. 4 А) остается такой же, как в случае контроля (кривая 1). Растворимость осадка в присутствии MIF улучшается, что также подтверждает его шапероноподобную активность.

1 2 3 4 5 6 7 8 А 67 Б 1 Рис. 5. SDS-электрофорез в 12% ПААГ солюбилизированных агрегатов. А. Ph b (мкг/мл) инкубировали при 42оС в течение 100 минут в отсутствие (дорожка 1) и в присутствии MIF в концентрации 25,2 мкг/мл (дорожка 2). MDH (26 мкг/мл) инкубировали при 40оС в течение 30 минут в отсутствие (дорожка 3) и в присутствии MIF в концентрациях 1,5; 3; 6 и 10 мкг/мл (дорожки 4, 5, 6 и 7 соответственно); маркеры молекулярных масс (кДа) (дорожка 8). Б. Нативный электрофорез в 10% ПААГ растворенных осадков после агрегации MDH (26 мкг/мл) в отсутствие MIF (дорожка 1), маркер молекулярной массы (67 кДа) (дорожка 2).

Для подтверждения того, что в присутствии MIF растворимость денатурированного белка увеличивается, был проведен следующий эксперимент. К осадкам MDH, полученным на конечной стадии тепловой агрегации, были добавлены растворы МIF в разных концентрациях.

Электрофорез полученных проб в неденатурирующих условиях показал, что по мере увеличения концентрации MIF растворимость осадка MDH увеличивается (Рис. 6). Наибольшая растворимость осадка MDH (26 мкг/мл) была показана при концентрации MIF 30 мкг/мл.

Рис. 6. Нативный электрофорез в 10% ПААГ 1 2 3 солюбилизированных осадков MDH (26 мкг/мл), полученных в результате тепловой агрегации в отсутствие MIF (дорожка 1) и в присутствии MIF в концентрациях 10 мкг/мл и 30 мкг/мл (дорожки 2 и соответственно); маркер молекулярной массы (67 кДа) (дорожка 4).

Полученные результаты могут быть обусловлены способностью MIF к образованию амфипатической вторичной структуры, при которой экспонированные наружу гидрофильные сайты MIF обеспечивают лучшую растворимость образовавшихся агрегатов.

Для определения олигомерного состояния денатурированного белкового субстрата и его предполагаемого комплекса с MIF была проведена эксклюзионная хроматография MDH в отсутствие и в присутствии MIF с использованием системы FPLC (Рис. 7). Образцы нагревали в течение 30 минут при 40,5оС (Рис. 4 А, кривые 1 и 4), затем центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут и наносили на колонку. При анализе образца, не содержащего MIF, на хроматограмме наблюдалось значительное уменьшение количества белка (Рис. 7 А, пунктирная линия). При хроматографии MIF-содержащего образца наблюдалось смещение пика влево по отношению к пику MDH (Рис. А), соответствующему 70 кДа (Рис. 7 Б.) Эти данные в сочетании с результатами электрофореза показывают, что MIF образует комплекс с MDH.

Рис. 7. Эксклюзионная хроматография MDH ( 67 A мкг/мл) в отсутствие (А) и в присутствии MIF (Б) на колонке Superdex 10/300 GL в системе FPLC.

Сплошной линией (А) показана MDH в отсутствие MIF при t=0, пунктирной – то же через 30 минут с момента начала агрегации при 40,5оС; MDH в присутствии 6 мкг/мл MIF (Рис. 4 А, кривая 3) после преинкубации при 40,5оС в течение 30 минут (Б). Стрелками показаны места выхода маркеров молекулярных масс.

Б Чтобы подтвердить присущую MIF шапероноподобную активность, были исследованы кривые агрегации субстратов.

С помощью программы Origin Pro 7.0 были рассчитаны Alim (кажущееся поглощение при t), tо (лаг-период), k (константа 14 16 Элюат, мл скорости 1-ого порядка), а также произведение Alim•k, являющееся критерием оценки начальной скорости агрегации (Курганов, 2002).

k, мин-1 Alim•k, мин-А Б 1, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 2.5 5.0 7.5 0 2 4 6 8 [MIF], мкг/мл [MIF], мкг/мл Рис. 8. Графики зависимости константы скорости 1-ого порядка (k) (А) и произведения предельного кажущегося оптического поглощения при t на константу скорости 1-ого порядка (Alim•k) (Б) от концентрации MIF (мкг/мл) в случае тепловой агрегации MDH (мкг/мл) при 40,5оС.

280, A mAU При увеличении концентрации MIF значения k и Alim•k уменьшаются (Рис. 8).

Исследование изменения биологической активности субстратов в процессе агрегации. Были проведены эксперименты по исследованию падения биологической активности белковых субстратов в процессе агрегации и после снятия денатурирующего воздействия в отсутствие и в присутствии MIF.

V/Vо V/Vо 1 А Б 1,1, 0,0,0,0,0,0,0,2 0,0,0,10 20 30 40 50 60 70 10 20 30 40 50 60 70 Время, мин Время, мин Рис. 9. Кинетика тепловой инактивации MDH (26 мкг/мл) при 39оС в отсутствие (А) и в присутствии MIF в концентрации 50 мкг/мл (Б) (сплошная кривая). Восстановление активности фермента при 25оС показано пунктирными линиями при тепловой инактивации в течение 5, 10 и 30 минут (кривые 1, 2 и 3 соответственно). По оси абсцисс – время инкубации.

По оси ординат – относительная скорость ферментативной реакции (V/Vо); Vо – значение V в отсутствие MIF.

Было показано, что при инкубации MDH (26 мкг/мл) в течение 5 – минут активность этого субстратного белка в отсутствие MIF (Рис. 9 А) падает в большей степени, чем в его присутствии (Рис. 9 Б). После снятия теплового стресса активность MDH восстанавливается в незначительной степени, а в присутствии MIF реактивация фермента в некоторых случаях достигает 100%.

Аналогичные результаты были получены и для Ph b при 42оС и 44оС (данные не показаны).

Таким образом, все исследованные характеристики агрегации подтверждают шапероноподобные свойства MIF. Показана его способность не только тормозить агрегацию модельных белковых субстратов, но и восстанавливать их ферментативную активность.

Усиление агрегации белков в присутствии MIF. Исследовали агрегацию ADH и Ph b при температурах 44оС и 48оС в отсутствие и в присутствии MIF в различных концентрациях (Рис. 10).

AA А Б 0,0, 0,0, 0,0, 0,0, 0,5 10 15 20 10 20 30 40 Время, мин Время, мин Рис. 10. Кинетические кривые агрегации ADH (70 мкг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии MIF в концентрациях 3,3 (2); 4,7 (3) и 10,8 (4) мкг/мл, зарегистрированные по увеличению оптического поглощения при 360 нм при 44oC в 20 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0 (А). Кинетические кривые агрегации Ph b (130 мкг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии MIF в концентрациях 10,8 (2), 28,8 (3) и 46,8 (4) мкг/мл при 48oC в 80 мМ Hepes буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 мM ЭДТА (Б).

Показано значительное ускорение агрегации субстратов и увеличение предельного значения кажущегося поглощения при 360 нм при t (Аlim) при субстехиометрических молярных соотношениях MIF : ADH (0,15 : 1) (кривая 2) и (0,2 : 1) (кривая 3). При соотношении (0,5 : 1) величина Аlim возрастает более, чем в 4 раза (кривая 4) (Рис. 10 А).

При этом по мере увеличения концентрации MIF наблюдается сокращение лаг-периода процесса агрегации, продолжительность которого в отсутствие MIF составляет около 4,5 минуты (кривая 1) (Рис. 10 А).

При субстехиометрических соотношениях MIF : Ph b (0,3 : 1) (кривая 2) и (0,8 : 1) (кривая 3) наблюдается значительный активирующий эффект MIF, а при увеличении концентрации MIF до уровня соотношения MIF : Ph b (1,5 : 1) (кривая 4) величина Аlim возрастает в 3,5 раза (Рис. 10 Б).

Полученные результаты отличаются высокой воспроизводимостью в большом числе экспериментов (для ADH n=9; для Ph b n=7). Важно также отметить, что в отсутствие белковых субстратов MIF не агрегирует даже при концентрациях, на порядок превышающих те, которые были использованы в указанных экспериментах, а также при инкубации при температуре 60оС в течение 240 мин.

Кроме того, характер кинетики агрегации ADH, проведенной в отсутствие и в присутствии 20 мМ -ME (Рис. 11), и результат влияния на данный процесс MIF принципиально не отличались. В этой связи можно полагать, что действие MIF на агрегацию субстрата не опосредовано образованием S-S-связей.

AРис. 11. Кинетические кривые агрегации ADH (70 мкг/мл) в отсутствие (1) или в 0,присутствии MIF в концентрациях 3,3 (2), 0,4,7 (3) и 10,8 (4) мкг/мл при 44oC в 20 мМ 0,Tris-HCl буфере, pH 7,0, содержащем 20 мМ 0,-ME.

0, 0,2 4 6 8 10 12 14 16 Время, мин Для первичного анализа состояния агрегатов после окончания процесса агрегации пробы центрифугировали, осадки солюбилизировали в 20 мМ Тris-HCl буфере, pH 7,0, содержащем 4 М мочевину (см. материалы и методы), и подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях (Рис. 12).

1 2 3 4 5 6 Рис. 12. Электрофорез в 12% ПААГ в присутствии Ds-Na солюбилизированных агрегатов Ph b и ADH после окончания 45 процесса агрегации. Дорожки 1 и 4 – 29 исходные препараты Ph b и ADH соответственно. Осадки, полученные в результате центрифугирования при 10 000 g суспензий Ph b (130 мкг/мл) после инкубации при 48oC в течение 25 минут в 80 мМ Hepes буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 мM ЭДТА, в отсутствие (дорожка 2), или в присутствии 46,8 мкг/мл MIF (дорожка 3).

Осадки суспензий ADH (70 мкг/мл) после инкубации при 44oC в течение 40 мин в 20 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0, в отсутствие (дорожка 5), или в присутствии 10,8 мкг/мл MIF (дорожка 6). Маркеры молекулярных масс (дорожка 7).

Анализ электрофореграммы показывает, что содержание в осадке Ph b (мономер, кажущаяся молекулярная масса 97 кДа) в присутствии MIF существенно возрастает (дорожка 3) по сравнению с пробой, не содержащей MIF (дорожка 2). То же наблюдается при инкубации ADH при 44оС в присутствии MIF (дорожка 6). Важным результатом проведенных экспериментов является обнаружение гетероагрегатов, содержащих как субстратный белок, так и MIF (мономер, 12 кДа) (дорожки 3 и 6).

Результаты электрофореза в ПААГ при неденатурирующих условиях супернатантов проб (10 000 g, 20 мин) после окончания процесса агрегации Ph b и ADH коррелируют с результатами электрофореза в присутствии Ds-Na, приведенными на Рис. 12. В супернатанте проб, инкубированных при повышенных температурах в присутствии MIF, содержание Ph b, или ADH значительно меньше по сравнению с аналогичными пробами, не содержащими MIF, в которых процесс агрегации субстратных белков происходил менее интенсивно (рисунок не приведен).

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»