WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |
на правах рукописи ЧЕРЕПКОВА Оксана Анатольевна ШАПЕРОНОПОДОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ФАКТОРА ИНГИБИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ МАКРОФАГОВ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2006 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель: доктор биологических наук Б.Я. Гурвиц Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.С. Шишкин доктор биологических наук Н.П. Шарова Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта Защита состоится 25 апреля 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_»_2006 г Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Молекулярные шапероны обладают способностью защищать белки, утратившие нативную конформацию при стрессорных воздействиях различного характера. Эта способность проявляется при взаимодействии шаперонов с гидрофобными участками развернутых или неправильно свернутых белков, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации и приводит, в конечном итоге, к сохранению их нативного состояния.

При температурах, превышающих физиологический уровень, в клетках наблюдается активация синтеза молекулярных шаперонов, известных как белки теплового шока (heat shock proteins, HSP). Некоторые из них (HSP70, GroEL) способствуют рефолдингу белков, подвергнутых тепловому повреждению, к нативному состоянию, в то время как другие (-кристаллин, малые HSP) только тормозят агрегацию белков и стабилизируют их структуру. Белковые агрегаты могут подвергаться солюбилизации и рефолдингу с образованием биологически активной конформации под действием системы шаперонов, входящих в состав мультишаперонной сети. В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга (пептидил-пролил-цис-транс изомераза и протеиндисульфидизомераза), различные шапероноподобные белки и пептиды [Puig et al., 1997; Sharma et al., 2000; Manna et al., 2001; Bhattacharyya et al., 2003].

В связи с многообразием и широким спектром действия шаперонов в различных компартментах клетки интерес к ним не ослабевает и список вновь открываемых шапероноподобных белков неуклонно растет. Однако, несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов при денатурации и агрегации белков в условиях стресса, молекулярные механизмы действия шаперонов остаются невыясненными.

Все известные в настоящее время шапероны обладают общими свойствами: они имеют гидрофобные домены, экспонированные на поверхности их молекулярных структур, способные узнавать и связывать определенные интермедиаты фолдинга белковых субстратов. Однако структурно функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны.

В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков, проявляющих способность к образованию амфипатической вторичной структуры. Одним из таких белков является фактор ингибирования миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor, MIF), принадлежащий к семейству цитокинов. Около 40 лет назад MIF был идентифицирован как фактор, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, по его способности тормозить миграцию макрофагов in vitro [Bloom and Bennet, 1966]. В последующие годы было показано, что низкомолекулярный высококонсервативный белок MIF (12,5 кДа) широко распространен в биологических объектах разной степени сложности (от бактерий до млекопитающих), его наибольшее количество обнаружено в макрофагах и в различных отделах мозга. Далее MIF был вновь «открыт» как медиатор системного ответа организма на стресс [Bucala, 1996; Donn and Ray, 2004], однако, его участие в биохимических механизмах формирования защитных реакций организма при тепловом шоке ранее не исследовалось, хотя структурно-функциональные характеристики MIF аналогичны многим шапероноподобным белкам.

Целью настоящей работы является изучение шапероноподобных свойств MIF в тест-системе in vitro, основанной на исследовании кинетики тепловой агрегации модельных белковых субстратов. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Выделить MIF из мозга быка в гомогенном состоянии и изучить его физико-химические и ферментативные свойства.

2. Исследовать влияние MIF на кинетику тепловой агрегации белковых субстратов – малатдегидрогеназы (MDH) из сердца свиньи, гликогенфосфорилазы b (Ph b) из скелетных мышц кролика и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (ADH) при различных температурах (41–48oC) и концентрациях белков.

3. Исследовать возможность реактивации частично денатурированных белковых субстратов под влиянием MIF.

4. Проанализировать изменения олигомерного состояния белковых субстратов и MIF при тепловом воздействии.

Научная новизна и практическая ценность работы. Наряду с традиционными представлениями о защите клеток от теплового повреждения с помощью системы, включающей шапероны и ферменты фолдинга, рассмотрена возможность существования пути регуляции, опосредуемого биологическими эффектами низкомолекулярных термостабильных гидрофобных белков, имеющих амфипатическую вторичную структуру.

Показано, что MIF, выделенный из мозга быка с использованием нового оригинального метода, обладает шапероноподобными свойствами. Это подтверждается следующими экспериментальными результатами:

• при исследовании кинетики термоагрегации MDH и Ph b турбидиметрическим методом продемонстрировано торможение агрегации белковых субстратов под действием MIF;

• обнаружено защитное действие MIF в процессе термоинактивации частично денатурированных MDH и Ph b;

• показано, что в зависимости от экспериментальных условий MIF может как тормозить, так и ускорять агрегацию белков. При температуре, близкой к физиологическому уровню (41,5оС), наблюдается образование легко растворимых агрегатов и стабилизация олигомерной структуры субстрата, что может способствовать ренатурации белка к нативному состоянию после снятия денатурирующего воздействия. Таким образом, в этих условиях MIF может играть шапероноподобную роль;

• анализ состояния агрегатов с помощью электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях показывает, что защитное действие MIF проявляется в торможении роста агрегатов субстратного белка.

Полученные данные позволяют существенно расширить представления о шапероноподобных белках, а также о механизмах регуляции их шаперонной активности. Наличие в молекуле шаперона гидрофильных сайтов способствует лучшему растворению гетероагрегатов, образующихся при тепловом стрессе.

Большой интерес к изучению механизмов действия молекулярных шаперонов вызван не только проблемами, связанными с процессами агрегации при получении рекомбинантных белков, но и с необходимостью разработки эффективных средств защиты клеток в условиях развития патологических состояний в результате нарушения конформации белков. Это направление исследований представляется также весьма перспективным в выявлении защитных реакций организма при температурах среды, близких к физиологически допустимому уровню (41–43оС), что может иметь большое значение в биологии и медицине.

Обладая выраженной стабильностью и способностью к образованию амфифильной вторичной структуры, стресс-индуцируемый белок, MIF, в сочетании с другими белками с аналогичными свойствами может войти в семейство конститутивно экспрессируемых «малых шаперонов», участвующих в адаптации организма к стрессу, на начальных этапах его развития.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука ХХI века” (Пущино, 2003); на 19-ой конференции Международного нейрохимического общества, ISN (Гонконг, 2003); на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); на Международном симпозиуме “Молекулярные механизмы регуляции функции клетки” (Тюмень, 2005), на FEBS конгрессе (Будапешт, 2005).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано печатных работ, в том числе 5 статей в ведущих российских и зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы включаетроллд наименования, в том числе на иностранных языках.

Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение MIF из мозга быка. Разработан метод выделения MIF в гомогенном состоянии, включающий гомогенизацию ткани мозга, нагревание гомогената (58оС, 20 мин), высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрацию на колонке с Toyopearl HW-55.

Электрофорез. Электрофорез хроматографически очищенных фракций белка проводили в 12%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na или в градиентном 515% ПААГ в неденатурирующих условиях. Белок проявляли нитратом серебра.

Кето-енол таутомеразная активность MIF. Ферментативную активность MIF определяли по скорости образования енол-изомера из кетоизомера п-гидроксифенилпирувата, использованного в качестве субстрата [Knox et al., 1957]. Измеряли увеличение абсорбции при 330 нм при комнатной температуре, используя спектрофотометр Beckman DU-650 (США).

Выделение гликогенфосфорилазы b (Ph b). Ph b выделяли по методу Юниса [Yunis et al., 1962]. Выход белка составлял 0,5 мг на 1 г сырой ткани.

Концентрацию фосфорилазы b определяли спектрофотометрически, используя коэффициент поглощения 13,2 для 1%-го раствора белка при 280 нм [Soman et al., 1983].

Определение шаперонной активности. Использовали тест–систему, основанную на подавлении тепловой агрегации модельных белковых субстратов. Агрегацию MDH и ADH в 20 мМ Tris–HCl буфере, pH 7,0 и Ph b в 80 мМ Hepes буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА, в отсутствие и в присутствии различных концентраций MIF измеряли на спектрофотометре Beckman DU-650 по изменению кажущегося оптического поглощения при нм.

Пробы, полученные после тепловой агрегации, центрифугировали (g, 20 мин). В случае Ph b осадки растворяли как в 4 М мочевине, так и в 80 мМ Hepes буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА; в случае MDH и ADH осадки растворяли в 20 мМ Tris–HCl буфере, pH 7,0. Полученные образцы анализировались с помощью электрофореза в ПААГ в нативных и денатурирующих условиях.

Для расчета молярных стехиометрических соотношений (MIF :

субстратный белок) использовали значения молекулярных масс субъединиц MDH, Ph b, ADH и MIF – 35, 97, 40 и 12 кДа соответственно.

Эксклюзионная хроматография в системе FPLC. Использовали ACTA FPLC систему (Amersham Biosciences, Pharmacia) на Superdex 10/300 347 GL колонке. Образцы MDH инкубировали при 40,5оC в течение 30 минут, центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут, затем наносили на колонку.

Скорость элюции – 0,5 мл/мин. Профиль элюции детектировали при 280 нм.

Ферментативная активность субстратов. Исследование активности Ph b в отсутствие и в присутствии MIF проводили при 30оС в 80 мМ Hepes буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА. Значения кажущегося поглощения раствора, содержащего 0,25 М гликоген, 0,1 мкМ Ph b и 1 мМ 5’-АМР, регистрировали при 340 нм. Реакцию инициировали добавлением -D-глюкозо-1-фосфата (мМ). Термоинактивацию Ph b при 42оС в термостате определяли по степени фосфоролиза гликогена. Аликвоты отбирали через определенные интервалы времени.

Активность MDH измеряли по поглощению при 340 нм в 100 мМ Tris– HCl буфере, pH 7,0, содержащем 0,5 мМ оксалоацетат и 0,28 мМ NADH, после инкубации субстрата при 39оС. Аликвоты отбирали из раствора через определенные промежутки времени и измеряли ферментативную активность MDH по степени превращения оксалоацетата в малат.

Концентрацию белка определяли по методу Bradford [Bradford, 1976].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выделение MIF из мозга быка. Был разработан простой оригинальный метод выделения MIF из мозга быка. Фракции, содержащие MIF, определяли по таутомеразной активности. Выход белка составлял 0,5 мг/мл на 1 г сырой ткани.

MIF выделялся в гомогенном состоянии. При электрофорезе в ПААГ в присутствии Ds-Na проявлялась единственная полоса, соответствующая кажущейся молекулярной массе 12 кДа (Рис. 1, дорожка 3). Анализ элюции MIF показал, что его выход в гомогенном состоянии является результатом сорбции на колонке, в основе которой лежат гидрофобные взаимодействия.

Использование буфера, содержащего 0,2 M KCl и/или 2 мМ -меркаптоэтанола (-ME), приводило к потере гомогенности (Рис. 1, дорожки 1 и 2).

1 2 3 Рис. 1. Электрофорез в 12% ПААГ в присутствии Ds-Na MIF-содержащих фракций, полученных на разных этапах выделения MIF. Дорожки: 1 и 2 – элюат с колонки Toyopearl HW-55 в 20 мМ KH2PO4 буфере, pH 6,8, содержащем 2 мМ -ME, в присутствии, или в отсутствие 0,2 М KCl соответственно; 3 – то же в 20 мМ KH2PO4 буфере, pH 6,8, в отсутствие KCl и -ME; 4 – маркеры молекулярных масс, кДа.

Для доказательства идентичности выделенного белка MIF после электрофореза проводили иммуноблоттинг с использованием PVDF мембраны (данные не показаны). Пятно, проявляющее иммунореактивность, вырезали и подвергали микросеквенированию. В соответствии с банком данных белковых структур полученная N-концевая последовательность (29 шагов) оказалась идентичной структуре MIF мозга теленка: NH2-PMFVVNTNVP RASVPDGLLS ELTQQLAQA.

С целью определения молекулярной массы нативного белка проводили электрофорез в неденатурирующих условиях (Рис. 2). Оказалось, что фракции MIF представляют собой смесь изоформ с различными молекулярными массами от 12 до 480 кДа (12, 48, 60, 120, 168 и 480 кДа - 1, 4, 5, 10, 14, субъединиц соответственно).

1 480 Рис. 2. Нативный градиентный (5-15%) электрофорез выделенного белка в ПААГ. 1 - изоформы MIF; 2 – маркеры молекулярных масс, кДа.

Была исследована также таутомеразная активность MIF как в отсутствие, так и в присутствии 2 мМ -ME при различных температурах (Рис. 3, А и Б). Как видно из рисунков, в присутствии 2 мМ -ME при нагревании до температуры 45оС, а в его отсутствие – при нагревании до температуры 42оС таутомеразная активность MIF увеличивается.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»