WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Определение интенсивности поражения. Для определения интенсивности поражения возбудителем плодовой гнили M. fructigena яблоко разрезали на диски толщиной 1,5-2 см, которые помещали во влажную камеру и инокулировали кусочком мицелия. Локализацию пораженной ткани определяли по побурению и изменению консистенции (размягчению). При необходимости проводили также микроскопическое исследование.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTIKA-5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. БЕЛКОВЫЙ ИНГИБИТОР ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ В РАСТЕНИИ КАРТОФЕЛЯ (SOLANUM TUBEROSUM L.).

1.1. Выделение и очистка БИПГ из клубней картофеля.

Хотя исследованию ингибитора в сочных плодах посвящено значительное число работ, в вегетирующих растениях он мало изучен, практически отсутствуют данные, посвященные клубням растений, в частности картофелю. Поскольку картофель является традиционным объектом исследования в нашей лаборатории и имеет большое практическое значение, мы провели изучение ингибитора полигалактуроназы в клубнях и побегах растения картофеля.

БИПГ выделяли из клубней картофеля сорта Невский. Для его очистки использовали гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-75 (рис. 1). Фракции 8-25, содержащие активность БИПГ, объединяли и дальнейшую очистку проводили с использованием ионнообменной хроматографии на КМ-сефадексе G-25.

% 2,5 Рис. 1. Гель-фильтрация 2 1 2 через сефадекс G-75 препарата 1,5 БИПГ из клубней картофеля сорта 1 Невский. 1 – D (280), 2 – 0,5 ингибирующее действие (% 0 ингибирования).

Номер фракции Во фракциях, полученных при элюции с КМ-сефадекса, определяли ингибирующее действие БИПГ. При хроматографировании с использованием ацетатного буфера рН 5,2 ингибитор связывался с КМ-сефадексом и элюировался 0,2 М NaCl в двух пиках (рис. 2).

% D (280) 0,4 Рис. 2. Ионнообменная хроматография препарата БИПГ на КМ-сефадексе G-25 (2,4 x 12,5).

0,3 Скорость элюирования 0,5 мл/мин, объем фракции – 2 мл. 1 – D(280), 0,2 2 – ингибирующее действие (% 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 ингибирования).

Номер фракции Активность БИПГ была обнаружена во фракциях 14-15 и во фракциях 22-24, которые сконцентрировали в концентрационных пробирках и использовали в аналитическом изоэлектрофокусировании на пластинах полиакриламидного геля с диапазоном рН 7 – 9. После изоэлектрофокусирования одна часть геля была окрашена, другую часть отрезали без покраски. Неокрашенную часть геля, содержащую трек с исходным препаратом разрезали на фрагменты размером 1 см, которые поместили в эппендорфов с ацетатным буфером рН 5,2. Элюция белков из геля проводилась 2 часа при комнатной температуре. Тестирование на активность показало наличие БИПГ в пробирках № 7 и № 8. Ингибирование ПГ тест-объекта в пробирке № 7 составляло 90 %, ) ( D а в пробирке № 8 - 100%. Фрагменты геля в пробирках соответствуют области с рI>8 на окрашенном геле (рис. 3).

pI 8.Рис. 3. Аналитическое изоэлектрофокусирование в дипазоне рН 7-9. 1 – после G –75, 2 – 14 фракция 8.45 после КМ - сефадекса, 3 – 15 фракция после КМ - 8.65 6 сефадекса, 4 – 22 фракция после КМ-сефадекса, 5 - исходный препарат БИПГ из клубней картофеля сорта Невский, 6 – неокрашенная часть геля, разрезанная на фрагменты.

1 2 3 4 5 Треки с фракциями 14 и 15 содержат полосу в области рI 8.8, а в треке с фракцией № 22 она не обнаружена. По-видимому, рI формы БИПГ, локализующейся во фракции 22, находится за пределами исследуемого интервала рН (7-9).

Препаративное изоэлектрическое фокусирование предварительно очищенного на сефадексе G-75 препарата БИПГ проводили в колонке с градиентом плотности сахарозы в диапазоне рН 7-9. Первый этап очистки представлен на рис. 4. Фракции № 21-содержали активность БИПГ. Фракции 21-24 соответствовали рН 8.8, а фракции 25-имели рН 8.9.

рН D (280) 2,4 2, Рис. 4. Первый этап 1,препаративного 1,1,изоэлектрофокусирования в 1,интервале рН 7-9. 1 – D (280), 2 – 0,2 рН. Стрелками указаны 0,0,4 начальная и конечная фракции с активностью БИПГ.

Номер фракции Фракции 21-28 с ингибирующей активностью объединили, сконцентрировали и использовали во втором этапе препаративного изоэлектрофокусирования с диапазоном рН 7-9. На рис. 5 видно, что только одна фракция № 23 имеет активность БИПГ.

Значение рI также соответствует ранее установленному значению равному 8.8.

pH D (280) 10 Рис. 5. II-й этап препаративного изоэлектрофокусирования в интервале рН 7-9. 1 – D (280), – рН. Стрелкой указана фракция с активностью БИПГ.

1 Номер фракции Как показали результаты SDS-ПААГ электрофореза, в этой фракции содержится высокоочищенный препарат БИПГ, обладающий высокой ингибирующей активностью (рис. 6). Все три полосы были вырезаны из геля и после элюции в ацетатном буфере рН 5,2 белки протестированы на активность. Только в одной полосе в районе 40 кДa обнаружена активность БИПГ.

kDa Рис. 6. SDS- ПААГ форез после препаративного изоэлектрофокусирования в диапазоне рН 7-9.

1 – маркеры, 2 – фракция № 23.

18.1 Результаты очистки БИПГ из клубней картофеля сорта Невский приведены в табл. 1.

Табл. 1. Частичная очистка БИПГ из клубней картофеля сорта Невский.

Удельное ингибирование Стадия очистки (усл.ед.) Исходный препарат 7,Сефадекс G-75 34,КМ-сефадекс 75,I этап изоэлектрофокусирования 80,II этап изоэлектрофокусирования 93,Ранее при очистке БИПГ из клубней картофеля сорта Истринский с использованием SP-сефадекса, выявлено также две формы БИПГ (Глинка и др., 1996).

Молекулярная масса одной из них определена в пределах 56-65 кДa. Молекулярная масса БИПГ из листьев картофеля сорта Spunta, составляла 41 кДa (Machinandiarena et.

al., 2001). Следовательно, в соответствии с имеющимися в настоящее время данными, БИПГ картофеля разных сортов несколько различаются по молекулярной массе.

Таким образом, мы получили высокоочищенный препарат БИПГ из клубней картофеля, что позволило выявить по крайней мере две его изоформы и определить для одной из них молекулярную массу 40±1 кДa и pI 8,8.

1.2. Содержание БИПГ в листьях картофеля на разных стадиях развития растения.

Растения в разной степени подвержены заражению теми или иными фитопатогенными микроорганизмами в зависимости от стадии онтогенеза (Дунин, 1946). Поскольку БИПГ может служить одним из факторов устойчивости, мы анализировали его содержание в листьях картофеля в связи со стадиями развития растения. БИПГ выделяли из листьев, расположенных в среднем ярусе побега картофеля сорта Невский на стадиях: 1) вегетативной, 2) генеративной: 2а) в фазе формирования соцветия, 2б) в фазе активного цветения, 2в) в фазе плодоношения и клубнеобразования.

В полностью сформировавшихся листьях картофеля выявлена активность БИПГ, содержание которого в конце вегетативной стадии было сравнительно высоким (рис. 7).

К началу генеративной стадии (в первой половине июля) его содержание уменьшалось, и к моменту формирования соцветия и закладки клубней (середина июля) было минимальным. Затем до конца цветения (конец июля) содержание ингибитора увеличивалось, а количество белка несколько снижалось к началу формирования плодов.

7 6 б 5 4 3 2 а а а 1 а 0 вегетативная стадия генеративная стадия генеративная стадия генеративная стадия (формирование (активное цветение) (плодоношение) соцветия) Стадии развития растения Рис. 7. Содержание БИПГ из листьев картофеля сорта Невский на разных стадиях развития растения.

а - ингибирование, б – содержание общего белка.

Изменение содержания БИПГ в листьях одного яруса, по-видимому, отражает важные изменения в обмене веществ всего растения, связанные как с переходом от вегетативной к генеративной стадии, так и с интенсификацией ростовых процессов при формировании клубней. При этом возможно изменение устойчивости растения к поражению теми фитопатогенными микроорганизмами, ПГ которых подвержена ингибирующему действию БИПГ картофеля.

1.3. Содержание БИПГ в клубнях картофеля в процессе хранения при разных условиях.

Как известно, температура окружающей среды существенно влияет на биохимические процессы в растении. Мы определяли содержание БИПГ в клубнях картофеля сразу после уборки и после хранения в течение 14 и 28 дней при температуре +18 С и +4 С (рис. 8). Через 14 дней после уборки содержание БИПГ в клубнях увеличивалось, причем несколько сильнее при +4 С, чем при +18 С. После 28 дней хранения содержание БИПГ несколько снижалось и оказалось практически одинаковым, независимо от температуры хранения. Действие низких температур способствует закаливанию некоторых растений, в том числе картофеля (Vega et al., 2000). При закаливании в растениях увеличивается содержание белков с LRR (Meyer et al., 1999).

Поскольку БИПГ также содержит LRR, возможно, в картофеле он играет роль такого белка, который накапливается при действии низкой температуры.

Ингибирование, усл. ед.

Содержание белка (мкг/мл) 10 б а б а Рис. 8. Содержание БИПГ а из клубней картофеля сорта Невский в условиях хранения при температуре +18 С (а) и +4 С (б).

1-й день 14 дней 28 дней Интервалы времени Активность БИПГ обнаружена в этиолированных ростках, образовавшихся на клубнях в конце хранения. Кроме того, нам удалось получить из ростков препарат, содержащий активность ПГ, которую обычно довольно трудно выявить в растительных тканях, вероятно, из-за низкой ее активности или маскировки действием ингибитора.

Препараты БИПГ, полученные из ростков, а также из клубней картофеля и плодов яблони, снижали активность ПГ в препарате из ростков. Ранее не удавалось выявить действие БИПГ на ПГ растения. По-видимому, при интенсивном растяжения клеток в этиолированных ростках происходят превращения пектиновых веществ, требующие накопления значительных количеств как ПГ, так и регулирующего ее активность БИПГ, что позволило их обнаружить в этом материале.

2. БЕЛКОВЫЙ ИНГИБИТОР ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ В КЛУБНЯХ ТОПИНАМБУРА (HELIANTHUS TUBEROSUS L.).

Топинамбур Helianthus tuberosus L. возделывается в ограниченных масштабах, хотя имеет большое значение в качестве источника витаминов и лекарственных веществ.

Он относится к группе растений, имеющих подземные запасающие органы в виде клубней (модифицированных стеблей) (Маркаров, 2001). В его тканях, как и в тканях картофеля, можно ожидать присутствие БИПГ. Ранее БИПГ топинамбура не изучали.

Препараты БИПГ получали из сформировавшихся клубней, собранных в октябре, а также хранившихся при температуре 4С и 20С. Препараты из свежесобранных клубней топинамбура ингибировали ПГ V. dahliae на 9%, что свидетельствует о присутствии в препарате БИПГ. В препаратах из клубней, хранившихся при 4С, активность БИПГ не выявлялась уже в ноябре, т.е. через месяц, тогда как при 20С она была в это время довольно высокой и приводила к ингибированию ПГ на 10%. В декабре активность БИПГ в клубнях топинамбура не выявлялась. Французские Ингибирование, усл. ед.

исследователи отмечали ингибирование прорастания клубней топинамбура при повышенной температуре (Coudroux, 1967). Возможно, что более высокое содержание БИПГ при 20С связано с его участием в ингибировании ростовых процессов.

3. БЕЛКОВЫЙ ИНГИБИТОР ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ В ПЛОДАХ ЯБЛОНИ (MALUS DOMESTICA Borkh.).

3.1. Содержание БИПГ в плодах яблони разных сортов в процессе роста и созревания.

Плоды яблони содержат значительное количество пектиновых веществ, поэтому они могут служить удобным объектом для изучения процессов, связанных с их превращениями, в частности, содержания БИПГ. БИПГ был ранее обнаружен в плодах яблони, однако динамика его содержания в процессе роста плодов ранее не изучалась.

Мы определяли содержание БИПГ в течение двух сезонов вегетации в плодах яблони сортов, различающихся по скороспелости, в процессе их роста на дереве, начиная с 40го дня после цветения с интервалом 2 недели.

Использованные в работе сорта яблок существенно различались по активности БИПГ, и содержанию белка, что, по-видимому, связано с разными темпами роста и развития плодов и сортовой специфичностью. Максимальное значение содержания БИПГ, достигаемое за все время эксперимента, у летних сортов (Коричное полосатое и Памяти Тихомирова) было существенно ниже, чем у ранне-зимнего (Антоновка обыкновенная) и поздне-зимних сортов (Московское позднее и Студенческое).

Исключение составлял поздне-зимний сорт Московское зеленое, в плодах которого максимальная активность БИПГ была такой же, как у летнего сорта Коричное полосатое.

При этом у Московского позднего высокое содержание БИПГ (рис. 9), так же, как и 12 Рис. 9. Динамика содержания БИПГ в плодах яблони сорта Москов- ское позднее. 1 - 2002 г., 2 – 2003 г.

Дата потребительские качества плодов, сохранялись в течение длительного времени (до ноября при хранении без охлаждения). Кривая, характеризующая содержание БИПГ, Ингибирование (усл. ед.).

.

.

.

.

.

.

6.

7.

9.

9.

0.

0.

1.

2.

2.

1.

1.

5.

...

.

.

.

....

.

....

.

.

.

.

.полученная в 2002 году, коррелирует с кривой, полученной в экспериментах 2003 года, что подтверждает коэффициент корреляции. Для Московского позднего он был равен 0,5 при уровне значимости p<0,05.

В процессе роста на дереве и затем после съема содержание БИПГ изменялось по-разному в плодах яблони разных сортов, однако выявлены некоторые общие закономерности. Отмечены два основных пика увеличения содержания БИПГ. Один, меньший, выявлен в период до наступления технической зрелости. Второй, значительно больший, проявлялся в процессе дозревания после съема плодов.

В период технической зрелости (ко времени съема плодов с дерева) происходило снижение содержания БИПГ, которое затем сильно возрастало. Следует отметить, что эти изменения происходили независимо от момента фактического отделения плодов от дерева. У сортов Антоновка и Московское зеленое кривая изменения содержания БИПГ имела несколько пиков, но сохранялась общая закономерность снижения его содержания ко времени технической зрелости и значительного повышения в период дозревания.

В плодах двух других исследованных видов рода Malus динамика содержания БИПГ сохраняла те же закономерности, что и в плодах сортов M. domestica (рис. 10).

Рис. 10. Динамика содержания БИПГ из плодов яблони двух диких видов рода Malus.

1- содержание БИПГ из плодов яблони Malus cаerulescens (2003 г.) 2- содержание БИПГ из плодов яблони Malus platycarpa (2003 г.) Дата В плодах M. platycarpa, имеющих очень плотную консистенцию, максимальное содержание БИПГ было выше, чем в других плодах. Плоды более скороспелого M.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»