WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

БУЗА НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА РОЛЬ БЕЛКОВОГО ИНГИБИТОРА ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗЫ В УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К БОЛЕЗНЯМ 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории биохимии фитоиммунитета Института биохимии им.

А.Н. Баха РАН.

Научный консультант:

доктор биологических наук М. А. Проценко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. Д. Щербухин кандидат биологических наук А. Н. Смирнов

Ведущая организация: Главный ботанический сад им. И. В. Цицина РАН

Защита диссертации состоится “ 18 ” апреля 2006 г. в “” часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.

Автореферат разослан “ 16 ” марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность проблемы. В устойчивости растений к болезням важную роль играет клеточная стенка, которая препятствует внедрению фитопатогенных микроорганизмов. Поэтому изучение биохимических процессов, развивающихся в клеточной стенке весьма актуально для изучения механизмов устойчивости и разработки способов ее повышения.

Как известно, растительная клеточная стенка представляет собой сложный комплекс, состоящий из микрофибрилл целлюлозы, погруженных в матрикс из пектиновых веществ, гемицеллюлоз, белков, низкомолекулярных веществ. Пектиновые вещества, представленные полисахаридами, обогащенными галактуроновой кислотой, являются наиболее массивным классом макромолекул в матриксе первичной клеточной стенки.

Многочисленные фитопатогенные грибы различаются по приуроченности к разным растениям: некоторые плесени поражают практически любой органический субстрат, другие грибы более специализированы, а некоторые поражают только определенные сорта одного вида растения и не поражают другие. Фитопатогенные грибы сильно различаются по воздействию на ткани растения. Некоторые из них вызывают размягчение и гнили тканей, внедрение других приводит к локальному повреждению и образованию разнообразных пятнистостей, третьи распространяются в растении, не вызывая развития видимых симптомов, но приводя к снижению урожая.

Для разработки методов борьбы с болезнями необходим анализ биохимических процессов, которые развиваются в растении при том или ином заболевании.

Внедрение фитопатогенного гриба в значительной степени обеспечивается активностью секретируемого грибом фермента полигалактуроназы (поли-[1,4--Dгалактуронид] гликаногидролаза, КФ 3.2.1.15 - ПГ), который катализирует гидролиз гликозидной связи -1,4 в полигалактуроновой цепи деметоксилированного пектина растительной клеточной стенки. ПГ присутствует также в интактных растительнных тканях, обеспечивая превращения пектиновых веществ при растяжении клеток в растущих побегах и подземных органах, при прорастании пыльцы, сбрасывании листьев, размягчении созревающих плодов и других процессах.

В числе белков клеточной стенки обнаружен ингибитор полигалактуроназы (белковый ингибитор полигалактуроназы – БИПГ). Пока мало изучена его роль в клеточной стенке растения, однако, интенсивно изучается его участие в устойчивости растений к болезням. Снижая активность ПГ, ингибитор затрудняет внедрение микроорганизмов и уменьшает разрушающее действие фермента (Albersheim et al., 1971). Кроме того, его действие приводит к видоизменению продуктов расщепления пектина, которые возникают в процессе патогенеза и оказывают влияние на многие биохимические процессы в клетке, в частности стимулируют реакции, препятствующие распространению патогена по тканям (Nothnagel et al., 1983). Многие исследователи выявили корреляцию содержания БИПГ в растительных тканях с их устойчивостью к поражению фитопатогенными грибами (De Lorenzo et al., 2001). Выявлены существенные различия в действии БИПГ из одного вида растения на ПГ разных грибов, а также в действии БИПГ из разных растений на ПГ из одного источника. Отмечено, что БИПГ, часто не действует на ПГ грибов, не поражающих растение, из которого он выделен, и в значительно меньшей степени влияет на ПГ грибов-патогенов данного растения (Глинка и др., 2001). Следовательно, растение поражается грибами, ПГ которых не ингибируется при действии БИПГ данного растения. Это позволяет считать БИПГ одним из важных факторов устойчивости растений к болезням.

Таким образом, БИПГ участвует в регуляции процессов в растении, как связанных с ростом и развитием, так и обусловливающих устойчивость к внедрению фитопатогенных микроорганизмов.

В настоящее время БИПГ обнаружен практически во всех тканях всех изучавшихся растений. Выяснена структура его молекулы, показано его сходство с белками – продуктами многих генов устойчивости (белками PR), охарактеризованы гены БИПГ из некоторых растений. Сравнение нуклеотидных последовательностей показало, что гены БИПГ ряда растений гомологичны в высокой степени (Favaron et al., 1994). Они кодируют полипептиды, содержащие повторности, обогащенные лейцином (белки LRR) и имеющие фиксированное положение цистеина.

Получены данные о различиях в экспрессии генов БИПГ в разных органах растений (Toubart et al., 1992; Stotz et al., 1993) и стимуляции экспрессии при поранении, заражении фитопатогенными грибами и действии некоторых других повреждающих факторов (Favaron et al., 1994; Bergman et al., 1994).

Роль БИПГ в биохимических процессах как в интактном растении, так и при патогенезе, остается неясной.

Цели и задачи исследования. Основная цель настоящей работы: изучение изменения содержания БИПГ в тканях растений на разных стадиях роста и развития, и влияние его на устойчивость к поражению фитопатогенными микроорганизмами.

В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Получить высокоочищенный препарат БИПГ из клубней картофеля.

2. Получить препараты ПГ из культуральной жидкости разных микроорганизмов и тканей растений для выявления действия ингибитора.

3. Изучить действие БИПГ растений на активность ПГ из разных источников.

4. Изучить изменение содержания БИПГ в плодах яблони сортов, различающихся по срокам созревания, и сопоставить с интенсивностью поражения их фитопатогенными грибами.

Научная новизна работы. Получен высокоочищенный препарат БИПГ из клубней картофеля сорта Невский, что позволило выявить по крайней мере две его изоформы и определить для одной из них молекулярную массу 40±1 кДа и pI 8,8. Изучено содержание БИПГ в плодах яблони различных сортов. Показано изменение его содержания в плодах в процессе роста и созревания. Обнаружена обратная корреляция содержания БИПГ с интенсивностью поражения плодовой гнилью Monilia fructigena, что свидетельствует о его участии в процессах, препятствующих распространению патогена по тканям плода. Впервые выявлена активность БИПГ в плодах банана и обнаружено его действие на собственную ПГ, которое свидетельствует о роли БИПГ в регуляции активности ПГ в тканях растения. Также впервые выявлена активность БИПГ в тканях клубней топинамбура.

Теоретическая и практическая значимость работы. В работе получена дополнительная информация по характеристике БИПГ из клубней мало изученного в этом отношении растения картофеля. Полученные результаты существенно дополняют информацию о роли БИПГ как в устойчивости к болезням, так и в процессах, связанных с ростом и развитием растения. Особенный интерес представляют данные об изменении содержания БИПГ в плодах яблони в процессе роста и хранения, а также об обратной корреляции устойчивости яблок к плодовой гнили с содержанием БИПГ в них.

Получены новые сведения о действии БИПГ на ПГ из растения, подтверждающие его участие в биохимических процессах в растении. Материалы диссертации могут быть использованы в специализированных учебных курсах, а также учтены при разработке способов повышения устойчивости растений к болезням и тестирования физиологического состояния растительного материала.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III Cъезде Биохимического общества в Санкт-Петербурге, 2002; на V Cъезде Общества физиологов растений в Пензе, 2003; на международных симпозиумах и конференциях: в г. СанктПетербурге, 2001, в г. Пущино, 2002, в г. Пенза, 2003, в г. Саратове и г. Минске, 2005 и др. По результатам диссертации опубликовано 15 печатных работ (3 статьи и тезисов).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы ( 171 ссылка).

Работа изложена на 120 стр. машинописного текста содержит 27 рисунков и 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты исследования. Частично очищенные препараты, обладающие активностью БИПГ, получены из следующих растений: клубни и листья картофеля (Solanum tuberosum) сорта Невский, клубни топинамбура (Helianthus tuberosus), плоды перца (Capsicum mexicanum), плоды яблони (Malus domestica) сортов: Коричное полосатое, Памяти Тихомирова, Антоновка обыкновенная, Студенческое, Московское зеленое, Московское позднее, и двух диких видов Malus platycarpa, Malus caerulescens, плоды банана (Musa sp.) сортов Кавендиш и Королевский, листья капусты (Brassica oleracea).

Препараты ПГ были получены из следующих источников: Verticillium dahliae (выделен c хлопчатника), Monilia fructigena (с яблок), Fusarium solani (с томата), F.

graminearum (с пшеницы), Phytophtora infestans (с картофеля), Gloeosporium musarum (с банана), а также ризосферные бактерии рода Pseudomonas (штаммы: 464, 30-84, 445, 279, 66, 146, 33-А), этиолированные ростки картофеля, плоды банана.

Выделение БИПГ. Для получения препарата БИПГ из вышеперечисленных растений определенное количество ткани гомогенизировали (в соотношении 1:2, вес:объем) в среде выделения, содержащей 20 мМ ацетатный буфер, рН 5.2 с 2 мМ меркаптоэтанола. Гомогенат, содержащий клеточные стенки, промывали и экстрагировали таким же буфером, содержащим 1 М NaCl, на магнитной мешалке при 4оС в течение 1 часа. Из экстракта материал осаждали (NH4)2SO4 при насыщении 90%, инкубировали в течение ночи при 4оС и центрифугировали 30 мин при 6000 g. Осадок растворяли с последующим обессоливанием.

Очистку препаратов БИПГ проводили с помощью гель-фильтрации (сефадекс G75), ионообменной хроматографии (КМ-сефадекс G-25) и препаративного изоэлекрического фокусирования (в градиенте плотности сахарозы в диапазоне рН 7-9) в соответствии с рекомендациями фирмы “LKB” (Hougland, 1971).

Получение культуральных фильтратов. V. dahliae, M. fructigena, F. solani, F.

graminearum культивировали в жидкой питательной среде, приготовленной на основе прописи, предложенной Малка и др. (Malka et al., 1966). Для выращивания P. infestans использовали модифицированный вариант среды Гроссмана (Grossmann, 1968).

Бактерии рода Pseudomonas выращивали на среде по прописи Шелл и др.

(Schell et al., 1988).

Получение препаратов ПГ. После культивирования грибов в течение 10 суток из культуральных фильтратов получали ферментные препараты. Мицелий отфильтровывали через капроновый фильтр, споры гриба осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 минут при 4°С. Полученный супернатант пропускали через миллипоровые фильтры фирмы “Synpor” c размером пор 0,45 мкм. Ферментные препараты получали осаждением сернокислым аммонием при 90% насыщении. После внесения в культуральный фильтрат навески (NH4)2SO4 раствор оставляли на ночь при +4°С, затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение минут. Полученные осадки растворяли в дистиллированной воде и диализовали в течение 20 часов против 200 объемов дистиллированной воды в диализных трубках “Visking Dialisis Tubing 8/32” (“Serva”, Германия). Получение препаратов ПГ из бактерий проводили аналогично. Из тканей растений препарат ПГ получали путем экстракции 20 мМ ацетатным буфером рН 5,2 с 2 мМ меркаптоэтанола, с последующим осаждением (NH4)2SO4.

Определение активности методом «cup-plate». В обессоленных препаратах определяли активность полигалактуроназы «чашечным» методом (Dingle, 1953).

Препарат вносили в лунки со специализированной, модифицированной средой содержащей 1% деметоксилированный пектин. Активность фермента проявлялась (с использованием 1% цетавлона) в виде обесцвеченной зоны вокруг лунок.

Интенсивность ингибирующего действия выражали в условных единицах (Усл. ед.), рассчитанных как процент уменьшения под действием БИПГ радиуса обесцвеченной зоны, отнесенный к количеству белка препарата и сырому весу ткани, из которой получен препарат.

Определение активности по редуцирующим группам. Активность ПГ определяли спектрофотометрически по увеличению количества редуцирующих групп, измеряемого при длине волны 595 нм (Milner, 1967). В качестве стандарта использовали Dгалактуроновую кислоту (фирма “Sigma”, США). За единицу активности (1 ЕРГ) принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль редуцирующих групп за 1 мин при 30° С. За единицу ингибирующей активности принимали количество ингибитора, необходимое, для уменьшения активности 1 ЕРГ в культуральном фильтрате V. dahliae на 50 %. Ингибирующую активность рассчитывали на 1 г веса сырого материала и выражали в единицах ингибирования (ЕИ).

Содержание белка в препаратах определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).

SDS-электрофорез в 10 % ПААГ проводили в модифицированной системе Лэммли (Laemmli, 1970), используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN II Electrophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США).

Аналитическое изоэлектрическое фокусирование осуществляли в пластинах ПААГ на приборе Multiphor II 2117 “LKB” (Швеция) в 1 % растворе амфолинов в градиенте рН 7-9.

Препаративное изоэлектрическое фокусирование проводили в соответствии с рекомендациями фирмы LKB (Haglund, 1971) на аналитической колонке LKB (Швеция).

Определение интенсивности выделения этилена проводили методом ГЖХ на приборе Хром-4 (Чехия) с плазменно-ионизационным детектором. Количество этилена определяли по калибровочной кривой и выражали в мкл/кг/сут.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»