WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

2D/D 0,a 2,возб. F F, отн. ед.

-0,б 2,0,0 1,-0,01 0,1,0 -0,1 0,0,5 -0,0,0 0 0,300 400 500 600 250 300 350 400 450 500 550 600 650 нм нм Рис. 11. Спектральные характеристики наночастиц CdS, синтезированных на Rфикоэритрине. а – спектр поглощения (1) и его вторая производная (2). б – спектр флуоресценции при возб 400 (1), 360 (2), 340 нм (3), 320 нм (4) и спектр возбуждения флуоресценции, рег 500 нм (5).

Переходы при 406 и 395 нм, определенные по второй производной спектра поглощения (рис. 11 а, кривая 2), соответствуют размеру частиц CdS 3,2±0,2 нм. Именно такого размера частицы проявляются по второй производной спектра поглощения цианобактерии N. muscorum инкубированный с кадмием. Размер наночастиц CdS, стабилизированных R-фикоэритрином, определяемый по спектру поглощения, согласуется с данными литературы (табл. 3).

В таблице 3 приведены лишь несколько работ из большого числа публикаций, в которых указываются размеры наночастиц CdS. Анализ данных литературы показал, что разброс в положении перехода из основного состояния в возбуждённое для частиц одного и того же размера колеблется от 1 до 8 нм по выборкам из 3-5 работ и в значительной мере определяется структурой наночастиц, методом определения их размеров, а также гомогенностью используемых матриц.

Таблица 3. Зависимость положения перехода из основного состояния в возбужденное частиц CdS от их размера Размер частиц, Положение пика перехода, нм Ссылка нм 330 Lingdong Sun et al., 2,5±0,2,8 350 Wang, Herron, 2,8 365 Dameron, Winge, 396-406 Собств. данные 3,2 ±0,4,0 455 Wossmeyer et al., 5,6 462 Wossmeyer et al., Размер частиц CdS, определяемый по спектрам поглощения, совпадает с диаметром туннельного пространства в центре гексамера, тогда как размер доминирующих частиц, определяемый по микрофотографиям, совпадает с длиной туннеля. Расхождение в определении размеров наночастиц по микрофотографиям и спектрам поглощения, повидимому, связано с гипохромным эффектом и обратной зависимостью интенсивности поглощения от размера частиц (чем больше размер, тем меньше коэффициент экстинкции) (Trindade et al., 2001). По этим причинам переход при 480 нм, соответствующий размеру частиц 6 нм, проявляется cлабо и только по второй производной спектра поглощения.

Флуоресцентные свойства наночастиц CdS. Спектр флуоресценции наночастиц сульфида кадмия размером от 3,2 до 5,6 нм в водном растворе R-фикоэритрина характеризуется максимумами излучения при 470 нм и 520 нм (CdS) и 575 нм (R-фикоэритрин) (рис. 11).

Соотношение полос в спектре флуоресценции не зависело от длины волны возбуждающего света и не изменялось при разбавлении даже в 70 раз. Вместе с тем в спектре возбуждения флуоресценции проявлялись несколько излучающих центров: при 280-290, 360, 395 и 440 нм (рис. 11 б, кривая 5). Последний был четко выражен при рег 500 нм. Излучающие центры не удалось разделить методами капиллярного электрофореза и фракционирования этанолом. На электрофореграмме CdS, стабилизированных R-фикоэритрином, имелся только 1 пик, а спектры поглощения супернатанта и суспендированного осадка, полученных при фракционировании наночастиц этанолом, совпадали. Совокупность этих данных свидетельствует, что наночастицы состоят из кластеров разных размеров, связанных молекулой Rфикоэритрина в гетероагрегат (рис.12). На модели наночастица CdS диаметром 3.2 нм, синтезируемая в полости R-фикоэритрина, представлена как совокупность кластеров разных размеров, между которыми происходит миграция энергии возбуждения. Кластеры плотно упакованы в единый гетероагрегат, который тесно связан с хромофорными группами R-фикоэритрина. На разный размер кластеров указывает сложная форма спектра излучения флуоресценции и зависимость положения максимума в спектре возбуждения флуоресценции от длины волны регистрации. О плотной упаковке кластеров в гетероагрегате свидетельствует миграция энергии возбуждения между кластерами.

Постоянное соотношение между полосами излучения кластеров CdS и R-фикоэритрином, которое не зависит от возб, свидетельствует о возможной ассоциации наночастицы CdS с хромофорными группами R-фикоэритрина. Образованию гетероагрегата, по-видимому, благоприятствует неоднородность полости фикоэритрина: наличие гидрофильных и гидрофобных зон, а также различных функциональных групп (–SH, –NH, –COOH), связывающих Cd2+.

Рис. 12. Схематические модели Rфикоэритрина с наночастицей CdS в центральной полости (а) и наночастицы CdS как гетероагрегата (б). а – Rфикоэритрин в форме гексамера ()изображен в виде двух параллельно расположенных дисков – тримеров ()3, в центральной полости локализована наночастица CdS; б – стрелки указывают перенос энергии возбуждения между кластерами (1) разных размеров и на хромофорные группы (2) R-фикоэритрина, как конечные акцепторы.

Фотохимические свойства наночастиц CdS. Освещение УФ-светом CdS, стабилизированного R-фикоэритрином, в анаэробных условиях в присутствии 7,8 мМ метилвиологена сопровождалось восстановлением последнего. Концентрация восстановленного метилвиологена не превышала 64 нМ после 40 мин освещения.

Фотовосстановление метилвиологена сопровождается вторичным синтезом CdS.

Бактерии-спутники и их роль в детоксикации ионов кадмия С целью выяснения возможной роли бактерий-спутников в образовании кристаллитов сульфида кадмия культурой цианобактерии эти микроорганизмы были выделены из исходного N. muscorum, а также из культур, инкубированных в течение 2-х месяцев с 10-М и 10-4 М Cd(NO3)2. В ходе исследования выделено 29 штаммов. Для штаммов, выделенных из предварительно очищенной культуры, все многообразие сводится к основным 3 типам: короткие подвижные палочки (длина 1-2 мкм), длинные подвижные палочки (длина более 2 мкм) и мелкие кокки. В ходе работы были отобраны чистые штаммов гетеротрофных бактерий и проверена их способность к образованию H2S на жидкой среде КМсп с добавлением по 0.02% цистина и цистеина. 8 штаммов выделяли H2S с разной интенсивностью. Для дальнейшей работы отобраны штаммы 1А и 2А, выделенные из исходной культуры N. muscorum, и штаммы 1В и 2В, выделенные из культуры цианобактерии, инкубированной с 10-3М Cd(NO3)2 в течение двух месяцев, которые наиболее интенсивно выделяли H2S и хорошо росли.

Влияние кадмия на интенсивность роста сопутствующих микроорганизмов изучено на жидкой и агаризованной среде. Динамика роста исследованных штаммов в отсутствие и в присутствии 10-3М Cd(NO3)2, типична для периодических культур (рис. 13). В присутствии Cd2+ рост 1В, 1А и 2А штаммов начинался с некоторой задержкой и менее интенсивен по сравнению с контролем. Скорость роста штамма 2А на среде с Cd2+ резко увеличивалась после 10-дневного периода адаптации и к концу периода наблюдения плотность культуры в два раза превышала таковую в контроле.

Рис. 13. Влияние кадмия на рост гетеротрофных бактерий, выделенных из культуры N.

muscorum. Бактерии (штаммы 1А, 2А, 1В, 2В) выращены в отсутствие кадмия (кривые 1А, 2А, 1В, 2В) и в присутствии 10М Cd(NO3)2 (кривые 1А+Cd, 2А+Cd, 1В+Cd, 2В+Cd) на жидкой среде КМсп. Оптическая плотность измерена на СФ-при 600 нм. Ошибка измерений 0,05 D.

При использовании агаризованной среды с 10-4М Cd(NO3)2 и в контроле без кадмия, посев проводили из суточных культур с одинаковой плотностью в разведениях 10-3 и 10-4.

В контроле для всех культур рост обнаруживался через 1 сутки и в обоих разведениях на 3 сутки был сплошной рост. На средах с добавлением Cd2+ культуры 1В и 2В образовывали газон на 3 сутки в 10-3 разведении, а в 10-4 выросло от 12 до 90 точечных колоний. Следует отметить, что при концентрации 10-3М Cd(NO3)2 на агаризованной среде бактерии не растут.

Связывание ионов кадмия сопутствующими микроорганизмами Исследование связывания кадмия с использованием дитизона культурами, выросшими на агаризованной среде, содержащей 10-4 М Cd2+, показало, что только культура 2В связывает Cd в этих условиях. Таким образом, среди гетеротрофных бактерий, обитающих в слизистой оболочке N. muscorum, имеются устойчивые к кадмию бактерии, которые способны выделять сероводород и связывать ионы кадмия. Установлено, что штамм 2В относится к кластеру видов рода Stenotrophomonas внутри подразделения гамма-протеобактерий. Согласно анализу последовательностей генов 16S рРНК изучаемый штамм относится к гетерогенному виду S. maltophilia.

Влияние кадмия на рост S. maltophilia на жидкой среде показано на (рис. 14).

0,Рис. 14. Кривые роста S.

0,maltophilia на среде КМсп: 1 - без 0,кадмия, 2 – с 10-4М Cd(NO3)2, 3 – 0,2.5·10-4М Cd(NO3)2, 4 – 5·10-4М 0,Cd(NO3)2, 5 – 7.5·10-4М Cd(NO3)2, 0,– 10-3М Cd(NO3)2. Оптическая 0,5 плотность, измерена на СФ-18 при 0,600 нм. Ошибка измерений 0,03 D.

0,0,0 1 2 3 4 5 6 7 8 сутки При концентрации 2.5·10-4М Cd(NO3)2 в среде в первые сутки биомасса культуры увеличивалась медленнее, чем в контроле, так как происходила адаптация клеток к кадмию. После 1-2 суток культура интенсивно начинала расти с общим повышением плотности суспензии и накоплением в среде продуктов метаболизма, способных связывать кадмий. В итоге снижалось количество свободных ионов Cd2+, приходящихся на клетку.

Связывание ионов кадмия S. maltophilia При внесении ионов Cd2+ 10-3 М в суспензию клеток, отмытых от среды в воде, и перемешивании в течение 5 минут, концентрация свободных ионов кадмия не менялась.

Это указывает на то, что сами клетки не способны связывать ионы кадмия в больших количествах. Связывание ионов кадмия отмечалось в процессе роста клеток. При внесении 5·10-4 М Cd(NO3)2 в среду с цистеином концентрация кадмия снижалась до 9·10-М, а в среде без цистеина – до 3·10-4 М, вследствие связывания Cd2+ компонентами среды.

После начала роста клеток при оптической плотности суспензии клеток 0,концентрация кадмия оставалась прежней. Однако, как только биомасса клеток увеличивалась до 0,2 D, концентрация кадмия в среде резко понижалась до 10-6 –10-7 М.

Снижение концентрации ионов Cd2+ связано с образованием CdS. Образование наночастиц CdS в культуре S. maltophilia видно по разнице спектров поглощения культуральной среды после осаждения клеток S. maltophilia центрифугированием (рис.

15). На кривой 2 рис. 15 явно выражено плечо в области 350 нм, характерное для оптическая плотность наночастиц CdS размером 2,8 нм, тогда как в спектрах поглощения клеток S. maltophilia отмытых от среды наблюдалось монотоноое увеличение поглощения в УФ- и синей областях спектра. Источником S2- был сероводород, образующийся в среде в процессе роста S. maltophilia.

Рис. 15. Спектры поглощения среды КМсп 1,с 0.02% цистеином после осаждения S.

maltophilia, инкубированной без кадмия (1) 0,и с 5·10-4 М Cd(NO3)2 (2).

0,300 320 340 360 380 длина волны, нм Таким образом, присутствие гетеротрофных бактерий-спутников способных выделять сероводород повышает устойчивость N. muscorum к кадмию. В целом отношения N.

muscorum со спутниками, устойчивыми к кадмию и способными продуцировать сульфид симбиотические. Это подтверждается тем, что выделенные клоны аксеничной культуры N. muscorum утрачивали способность роста и погибали через 1-3 месяца. Отсюда следует, что создание искусственной ассоциации цианобактерии с гетеротрофными бактериями, устойчивыми к Cd2+ может обеспечить связывание ионов Cd2+ и повысить устойчивость цианобактерии к токсическому действию этого тяжелого металла.

Заключение Совокупность собственных и литературных данных позволяет заключить, что присутствие солей кадмия в среде стимулирует в цианобактериях активацию системы защиты от Cd2+, которая направлена на снижение концентрации свободных ионов токсичного металла и включает следующие механизмы: ускоренный синтез и выделение во внешнюю среду полисахаридов измененной первичной структуры для дистанционной детоксикации ионов кадмия; трансформирование Cd2+ в менее токсичные частицы и кристаллиты CdS и Cd0 на слизистой оболочке при участии бактерий-спутников, а также поглощение в клетках при помощи фикобилиновых пигментов и специфического металлсвязывающего белка, типа металлотионеина, синтез которого индуцируют ионы кадмия.

Cd2+ Увеличение скорости Изменения в фотосинтетическом Индукция синтеза синтеза полисахаридов аппарате при воздействии Cd2+: белков, изменённой первичной образование Cd-пигментных связывающих Cd2+ структуры комплексов и активация ФС1 (Cobbett, 2000) Ускоренное Дистанционная обновление детоксикация слизистой оболочки R–N=Cd; R–P=Cd;

CdS Бактерии-спутники R–CO–Cd–OC–R Рис. 16. Гипотетическая схема системы защиты цианобактерии N. muscorum от ионов Cd2+.

Схематическое изображенеие системы защитных механизмов от ионов кадмия представлены на рис. 16. Перечисленные механизмы дополняют друг друга и действуют одновременно. Энергетические затраты, связанные с преодолением Cd-стресса, могут компенсироваться в результате активации ФС 1.

Выводы 1. Полисахариды, выделяемые N. muscorum в культуральную среду, способны связывать ионы кадмия, предохраняя тем самым клетки от токсического воздействия Cd2+. Впервые показано, что в присутствии ионов кадмия выделение полисахаридов усиливается и происходит изменение в их составе: доминирующим моносахаридом становится глюкозамин.

2. Обнаружено, что в культуре N. muscorum инкубированной с кадмием в концентрации (10-4М), не влияющей на скорость роста и морфологию, наблюдается усиление переноса энергии от ФС2 к ФС1, тогда как при концентрации Cd2+ 10-3 М, инициирующей отмирание клеток, перенос энергии между фотосистемами сильно уменьшается.

3. Фикобилиновые пигменты способны связывать ионы кадмия in vivo и в водных растворах. Показано, что в спектрах поглощения и флуоресценции N. muscorum инкубированной с ионами кадмия образуются новые полосы, которые могут быть отнесены к CdS и Cd-белковым комплексам.

4. Синтезированы наночастицы сульфида кадмия с использованием R-фикоэритрина в качестве стабилизатора. Размер частиц, связанных с R-фикоэритрином, зависит главным образом от соотношения концентраций ионов S2- и Cd2+, концентрация R-фикоэритрина не влияет на размер синтезируемых частиц CdS. Совокупность данных спектрального анализа, электронной микроскопии и капиллярного электрофореза свидетельствуют, что частицы CdS диаметром 3.2 нм представляют собой гетероагрегаты.

5. Высокая стабильность частиц CdS, совпадение их размеров с размерами (3.5 6 нм) полости в центре гексамера R-фикоэритрина, а также сходство электрофореграмм свободного R-фикоэритрина и в комплексе с CdS указывают, что наиболее вероятным местом синтеза наночастиц являются туннельные полости пигмента.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»