WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Пробы вводили 5 секунд при избыточном давлении 50 мбар. Рабочее напряжение 15 кВ, детектирование при 254 нм.

Спектральные измерения выполнены при помощи следующих спектрофотометров:

СФ-18, Hitachi-557, Beckman coulter DU 650, Specord UV-VIS “Carl Zeiss” и флуориметров: MPF-4, “Hitachi”, RF-5301 PC “Shimadzu”.

Результаты и их обсуждение Влияние ионов кадмия на биомассу и морфологию N. muscorum в зависимости от концентрации и длительности воздействия. Исследование воздействия кадмия в различных концентрациях на N. muscorum показало, что в присутствии 10-4 М Cd(NO3)цианобактерия оставалась жизнеспособной в течение нескольких месяцев наблюдений, при этом морфология клеток, прирост биомассы, скорость выделения кислорода и интенсивность дыхания были такими же, как в культуре без кадмия (рис. 1 а, б; табл. 1).

Таблица 1. Изменения биомассы N. muscorum (мг·сух. биомассы / мл) при инкубировании с Cd2+ Продолжительность Концентрация Cd(NO3)2, М экспозиции, сутки 0 10-4 5·10-4 10-0 1,72±0,06 1,74±0,01 2,14±0,13 1,76±0,3 1,75±0,15 - - 1,55±0,9 1,96±0,18 2,02±0,12 2,24±0,04 1,24±0,Изменение биомассы за 9 суток + 0,24 + 0,28 + 0,10 - 0,Рост цианобактерии замедлялся и размер клеток уменьшался, если в культуральную среду вносили 5·10-4 М Cd(NO3)2 (рис. 1 в). Ионы Cd2+ в концентрации 10-3 М вызывали снижение биомассы на 30 % за 9 суток, распад нитей на фрагменты и отдельные клетки, удерживаемые общей слизью (рис. 1 г). Через три-четыре недели инкубирования с 10-3 М Cd(NO3)2 слизистые оболочки отделялись от трихомов, формировались скопления колониальной слизи, содержащие сгустки частиц, имевших вид кристаллитов, зёрен и более массивных образований в виде друз. Слизистая оболочка трихомов, а также сгустки слизи, отделившиеся от нитей колоний, образовывали комплекс с дитизоном жёлтооранжевого цвета. Интенсивность цвета и площадь окрашенных участков увеличивалась с возрастанием концентрации кадмия и длительности экспозиции (в пределах 1 часа). Часть бактерий-спутников также приобретали оранжевую окраску в присутствии дитизона. В отсутствие Cd2+ окрашивание исходной культуры дитизоном не происходило.

Рис. 1. Цианобактерия N. muscorum, выращенная на среде без кадмия (а), в присутствии Cd2+: 10-4 М (б), 5·10-4 М (в), 10-3 М (г). (а), (б) – контрастированы тушью, (г) – фазовый контаст. Длительность инкубирования 7 суток.

При инкубировании N. muscorum с ионами Cd2+ поглощение культуральной среды в УФ- и видимой области при длинах волн короче 600 нм монотонно увеличивалось (рис. 2, кривые 2, 3). Именно такое поглощение при длинах волн короче 400 нм без четко выраженных максимумов характерно для CdS. Максимум флуоресценции смещался от 440 нм в длинноволновую область, при этом вид спектра и интенсивность излучения зависели от концентрации кадмия в среде (рис. 2, кривые 4-6). Эти изменения в спектрах поглощения и флуоресценции культуральной среды после инкубации цианобактерии с кадмием позволяют предположить, что связанный кадмий хотя бы частично накапливается экзометаболитами в виде сульфида кадмия.

Рис. 2. Спектры поглощения (1-3) и флуоресценции (4-6) культуральной среды после инкубирования в ней N. muscorum без кадмия (1, 4) и в присутствии 10-4 М (2, 5) и 10-3 М Cd(NO3)(3, 6); дифференциальный спектр поглощения культуральной среды после инкубирования в ней N. muscorum («с 10-4 М Cd(NO3)2» минус «без кадмия») (7, 8). Длительность инкубирования суток (кривые 1-7) и 35 суток (кривая 8).

Роль внеклеточных полисахаридов N. muscorum в детоксикации ионов кадмия.

Удельное содержание полисахаридов, экскретируемых цианобактерией N. muscorum при плотности культуры 2 г/л сухой биомассы, было равно 0,7 ± 0,01 г глюкозных единиц в расчете на 1 г сухой биомассы. После экспозиции N. muscorum с Cd2+ содержание экзополисахаридов в культуральной среде возрастало. Динамика концентрации экзополисахаридов в культуральной среде зависела от количества вносимого кадмия и продолжительности инкубирования с ним N. muscorum (рис. 3).

Рис. 3. Изменение содержания экзополисахаридов в культуральной среде в зависимости от концентрации Сd2+ в среде и длительности инкубирования N. muscorum.

Цифры у кривых: 1 – 0 М, 2 – 10-4 М, 3 - 5·10-4 М, 4 – 10-3 М Cd(NO3)2.

Одновременно с изменением концентрации экзополисахаридов изменялась их первичная структура, о чём свидетельствуют различия в спектрах поглощения гидролизованных экзополисахаридов (рис. 4). После инкубирования N. muscorum с 10-3 М Cd(NO3)2 основной максимум в спектре поглощения смещался к 325 нм и обнаруживался дополнительный при 272 нм (рис. 4 б; кривая 1).

а 0,0,б 0,0,0,3 0,0,0,0,9 0,0,0,220 240 260 280 300 320 340 220 240 260 280 300 320 340 длина волны, нм длина волны, нм Рис. 4. Спектры поглощения гидролизованных экзометаболитов, выделяемых N.

muscorum в культуральную среду, а – в отсутствие кадмия, б – в присутствии 10-3 М Cd(NO3)2. Длительность инкубирования 9 суток. Цифры у кривых: 1 – экспериментальная кривая, 2 – сумма компонентов разложения, 3 – глюкозамин, 4 – глюкуроновая кислота, 5 – арабиноза, 6, 7, 8 – неидентифицированные компоненты, 9 – галактоза, 10 – глюкоза, 11 – рамноза.

поглощение поглощение Разложение спектра поглощения гидролизованного полисахарида на спектры индивидуальных моносахаридов позволило конкретизировать изменения, происходящие в первичной структуре полисахарида при инкубировании N. muscorum с кадмием (рис. 4).

Спектр поглощения гидролизованного полисахарида из контрольного опыта без кадмия (рис. 4 а), раскладывается на спектры следующих моносахаридов: глюкозамин, глюкуроновая кислота, галактоза, глюкоза, арабиноза, рамноза (перечислены в порядке уменьшения их вклада в основную полосу поглощения) и 3-х неидентифицированных компонентов, поглощение которых описывается гауссовыми кривыми с максимумами при 215 нм, 227 нм и 263 нм. Возможно, последние обусловлены поглощением неуглеводных компонентов экзометаболитов (см. рис. 2, кривая 8). Спектр поглощения полисахарида, присутствующего в культуральной среде после инкубирования N.

muscorum с Cd, раскладывается на меньшее количество компонентов, при этом явно доминирует поглощение глюкозамина (рис. 4 б).

Таким образом, комплексные определения концентрации экзополисахаридов в культуральной среде, коррелирующие с толщиной слизистой оболочки, изменения первичной структуры экзополисахаридов и биомассы цианобактерии, а также связывания ионов кадмия (по реакции с дитизоном) после инкубирования с ионами кадмия в различных концентрациях позволяют заключить, что N. muscorum способен к активному и избирательному выделению ионов кадмия во внешнюю среду для дистанционной детоксикации. Способ защиты обеспечивается, по-видимому, активацией синтеза полисахарида изменённой первичной структуры.

Изменчивость фотосинтетического аппарата N. muscorum при воздействии ионов кадмия.

Основными компонентами в пигментной системе N. muscorum штамм ВКМ-являются хлорофилл, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин и каротиноиды. В качестве минорного компонента содержится фикоэритроцианин. Каждый из основных пигментов представлен двумя и более спектральными формами (табл. 2).

Кадмий при всех исследованных концентрациях вызывал изменения в фотосинтетическом аппарате. Однако, если при концентрации 10-4 М Cd2+ их удавалось регистрировать только при 77 К, то при 5·10-4 М Cd2+ после 9 суток инкубации изменения обнаруживались спектральными методами при комнатной температуре, а при 10-3 М Cd2+ изменения наблюдались даже визуально по обесцвечиванию культуры.

Из данных, суммированных в табл. 2, следует, что отличия в спектрах поглощения N.

muscorum до и после инкубирования с 10-4 М Cd2+ заключались в смещении максимумов поглощения на 1-4 нм и возникновении новых полос при длинах волн < 410 нм (обусловленных, по-видимому, поглощением наночастиц CdS), 586 нм (Cdфикобилипротеиновый комплекс) и > 730 нм (хлорофилл-белковые комплексы, модифицированные кадмием). После инкубирования с 10-3 М Cd2+ поглощение в красной области сильно снижалось, по сравнению с контролем в результате обесцвечивания хлорофилла и основной максимум смещался от 678 к 666 нм; полосы поглощения в области 470-540 нм отсутствовали, что указывает на деструкцию каротиноидов; полос в области < 410 нм становилось больше, что, возможно, отражает возрастающее разнообразие частиц CdS по размерам и носителям (табл. 2). Предположение подтверждается появлением новых полос излучения в низкотемпературном спектре флуоресценции N. muscorum после инкубирования с 10-4 М Cd2+ и 10-3 М Cd2+, измеренных при селективном возбуждении светом, поглощаемым преимущественно хлорофиллом (430 нм) или фикобилипротеинами (530 нм) (табл. 2, последний столбец).

Возгорание длинноволновой флуоресценции хлорофилла ( 700 нм) после инкубирования N. muscorum с 10-4 М Cd2+, измеренных при селективном возбуждении светом поглощаемым преимущественно хлорофиллом (430 нм) или фикобилипротеинами (530 нм) указывает на усиление переноса возбуждения в ФС1 (рис. 5 кривые 1,2). Вывод подтверждается тем, что в спектре возбуждения флуоресценции при 770 нм доминируют полосы, соответствующие максимумам поглощения фикобилипротеинов.

Сопоставление спектров флуоресценции N. muscorum до и после инкубирования с 10-М Cd2+ позволяет заключить, что перенос энергии возбуждения от фикобилипротеинов на хлорофилл практически не происходит, собственная флуоресценция хлорофилла снижается почти на два порядка (рис. 5 кривые 1,3).

Таблица 2. Положение отрицательных пиков (нм) во второй производной низкотемпературного спектра поглощения N. muscorum в зависимости от концентрации ионов кадмия в среде, длительность инкубации 7 суток Компонент Концентрация Cd2+ в среде, М 0 10-4 10-CdS – 391 F450*) – 393 – F398 F406 Fп 415 415 Хлорофилл 419 418 – – 443 445 472 471 – п 477 477 – – 500 – Каротиноиды п 507 507 – 509 – – 514 514 – – 532 – 544 540 – Фикоэритрин 558 559 554 F571 569 573 FКомплекс – 586 586 FCd-фикобилипротеин Фикоэритроцианин 596 599 – – Фикоцианин – – 618 F621 622 631 633 Аллофикоцианин 658 659 Форма 674 673 хлорофилла 686 686 714 714 – – Cd-хлорофилл белковые комплексы 751 F*) Цифры в сочетании с буквой F указывают положение максимумов флуоресценции (нм), возникающих в присутствии кадмия Рис. 5. Спектры флуоресценции N. muscorum при 295 К в зависимости от концентрации ионов кадмия в культуральной среде, (а) возб =430 нм, (б) возб =530 нм. Цифры у кривых:

1 - контроль без кадмия, 2 - 10-4 М Cd2+, 3 - 10-3 М Cd2+.

Связывание ионов кадмия R-фикоэритрином Поскольку мы обнаружили, что фикобилиновые пигменты связывают ионы кадмия в N. muscorum, представляло интерес исследовать синтез CdS при участии фикобилиновых пигментов в модельных системах. Для решения этой задачи был выбран R-фикоэритрин (пигмент красной водоросли), как наиболее стабильный из всех фикобилиновых пигментов.

При добавлении к раствору R-фикоэритрина ионов кадмия в концентрации от 7·10-до 3,5·10-2 М потенциал кадмиевого электрода увеличивался, что свидетельствует об уменьшении концентрации свободных ионов Cd2+ в среде. Измерения ЕCd показали, что при варьировании концентрации Cd2+ в указанных пределах 1,8 мкМ фикоэритрин за короткое время связывал от 20 до 70 % Cd2+. В результате образовывался Cd2+фикоэритриновый комплекс.

При связывании ионов кадмия R-фикоэритрин оставался хорошо растворимым в воде, но поглощение и интенсивность флуоресценции R-фикоэритрина снижались в той или иной степени в зависимости от количества связанного им кадмия и рН среды.

Зависимость размера частиц CdS от условий синтеза. При добавлении сульфида натрия к Cd-фикоэритриновому комплексу синтезировались частицы CdS и обесцвечивался R-фикоэритрин. Частицы были устойчивы и не выпадали в осадок.

Исследование зависимости размера частиц CdS от соотношения концентраций S2- : Cd2+ :

R-фикоэритрин и рН среды показало, что он зависит главным образом от соотношения концентраций ионов S2- и Cd2+ (рис. 6); зависимость от рН среды незначительна (рис. 7), а концентрация пигмента вовсе не влияла на размер синтезируемых частиц CdS (рис. 8).

Размер наночастиц колебался от 2 до 5.6 нм в зависимости от условий синтеза, указанных в подписях к рисункам 6-8.

Рис. 6. Зависимость оптических свойств CdS от соотношения концентраций ионов сульфида и кадмия во время синтеза (реакционная смесь содержала 8 мМ Сd2+, мкМ R-фикоэритрин и [S2-] в мМ, указаны у кривых): а – спектры поглощения частиц CdS, стабилизированных Rфикоэритрином, б – поглощение при 350 нм (А350) и интенсивность флуоресценции при 500 нм (F500), возб 400 нм частиц CdS в 0,01 М трис-буфере, рН 7,5.

Рис. 7. Спектры поглощения при различных рН (цифры у кривых) (а) и зависимость интенсивности флуоресценции при 500 нм (возб = 400 нм) от рН (б) для наночастиц CdS (образец – 1.мкМ R-фикоэритрин, 10 мМ Сd2+, 48 мМ S2-).

Рис. 8. Спектры поглощения при различных концентрациях R-фикоэритрина (цифры у кривых, в мкМ) (а) и зависимость интенсивности флуоресценции наночастиц CdS при 500 нм (возб = нм) от концентрации Rфикоэритрина (б); условия синтеза: 12 мМ· Сd2+, 14 мМ S2-, рН 8.7.

Размер и фазовое состояние наночастиц CdS. Определения размеров частиц по микрофотографиям показали, что присутствовали частицы размером от 2 нм до 1,1 мкм.

Доминировали частицы 6,05 нм. Среднеквадратичное отклонение составляло 1,82 нм (рис. 9).

Рис. 9. Распределение по размерам частиц CdS, стабилизированных Rфикоэритрином. Среднеквадратичное отклонение 1,82. На вставке – электронная микрофотография доминирующих частиц и микродифракционная картина характерная для них. Условия синтеза:

0,5 М Cd2+, 1,8 мкМ R-фикоэритрина, 0,3 М Na2S в пропорции [S2-]/[Cd2+]=1,2.

На вставке рис. 9 представлена электронная микрофотография наиболее мелких частиц. Они из-за небольшого количества вещества, давали слабую микродифракционную картину, на которой присутствовал 1-2 максимума (рис. 9).

Поэтому достоверно определить фазовое состояние наночастиц размером 6 нм не удалось. Среди крупных частиц имелись кристаллические, аморфные и двухфазные аморфно-кристаллической структуры. Энергодисперсионный спектр рентгеновского характеристического излучения одной из частиц представлен на рис. 10. Крупных частиц было очень мало.

Рис. 10. Энергодисперсионный спектр рентгеновского характеристического излучения частицы CdS, синтезированной на R-фикоэритрине. На вставке – электронная микрофотография, на которой стрелками отмечены кристаллическая (1) и аморфная (2) частицы CdS, и соответствующие им микродифракционные картины.

Спектры поглощения и флуоресценции наночастиц сульфида кадмия, изображенных на микрофотографиях, представлены на рис. 11.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»