WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

Бреховских Александр Андреевич Защитные механизмы автотрофной цианобактерии Nostoc muscorum от токсического воздействия ионов кадмия 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006 2

Работа выполнена в лаборатории фотобиохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научный консультант:

кандидат биологических наук О.Д. Бекасова Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н.В. Карапетян доктор биологических наук Л.М. Герасименко

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В Ломоносова, биологический факультет

Защита диссертации состоится « 21 » марта 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « 10 » февраля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский 3

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Кадмий относится к группе самых опасных элементов, так как способен нарушать многие физиологические и метаболические процессы путем прямого ингибирования или активации, а также непрямым воздействием на регуляторные механизмы, образуя прочные комплексы с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими НS- и RS-группы, заменяя металлы в металлсодержащих ферментах.

Цианобактерии могут аккумулировать кадмий наряду с другими тяжелыми металлами быстро и в больших количествах. Генетическая модификация цианобактерий усиливает их устойчивость к токсичным элементам и способность аккумулировать тяжелые металлы (Shi et al., 1998). Изучение конкретных видов, характеризующихся устойчивостью к высоким концентрациям Cd2+, представляется актуальным как в практическом, так и теоретическом аспектах. Практический интерес обусловлен использованием цианобактерий, при разработке технологий осаждения и удаления тяжелых металлов из промышленных стоков биоаккумуляцией - более эффективным и дешевым способом удаления токсичных металлов из окружающей среды по сравнению с физико-химическими методами. Теоретический интерес обусловлен обнаружением способности у некоторых микроорганизмов, в том числе и N. muscorum, к биосинтезу наночастиц CdS в процессе детоксикации ионов Cd2+. CdS – неорганический полупроводник, обладает фотохимической активностью и способен фотосенсибилизировать биохимические окислительно-восстановительные реакции (Красновский и др., 1979). К настоящему времени осуществлен ряд ферментативных реакций, фотосенсибилизированных неорганическими полупроводниками, включая сульфид кадмия (Никандров и др. 1994). С перспективой технического использования созданы системы на основе гидрогеназы, сопряженной с CdS в качестве фотосенсибилизатора, способные к выделению молекулярного водорода (Недолужко, 1998). Наночастицы со свойствами полупроводников находят широкое применение в фотокатализе и других областях науки и техники благодаря уникальным фотофизическим и химическим свойствам, которые зависят от размеров частиц (Бучаченко, 2003). С целью получения наночастиц определенного размера и свойств развиваются методы их синтеза и биосинтеза. Привлекательность фикобилиновых пигментов для стабилизации наночастиц заключается в идентичности туннельных полостей в центре пигментных молекул, что существенно для синтеза одноразмерных частиц, когда требуются очень малые реакционные объемы. Возможность стабилизации наночастиц сульфида кадмия фикобилипротеинами ранее не исследовалась.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы было изучение защитных механизмов цианобактерии Nostoc muscorum штамм ВКМ-16 от воздействия ионов кадмия. Поставленная цель определила задачи диссертационной работы:

1. Изучить влияние ионов кадмия в широком диапазоне концентраций (10-6 – 10-2 М) на жизнеспособность N. muscorum и микроорганизмы, обитающие в его слизистой оболочке.

2. Выявить возможные способы детоксикации ионов Cd2+ N. muscorum, включая участие экзополисахаридов и фикобилиновых пигментов в связывании ионов Cd2+.

3. Синтезировать наночастицы сульфида кадмия in vitro, используя фикоэритрин в качестве белковой матрицы; выяснить влияние условий синтеза на размер наночастиц СdS; исследовать их спектральные и фотохимические свойства.

4. Получить бактериологически чистую культуру N. muscorum и выяснить ее устойчивость к ионам Cd2+.

5. Выделить из альгологически чистой культуры N. muscorum бактерии-спутники, устойчивые к токсическому действию кадмия, охарактеризовать их и исследовать способность к связыванию ионов Cd2+.

Научная новизна. Показано противоположное действие низких и высоких концентраций кадмия на биомассу, морфологию, фотосинтетический аппарат и выделение экзополисахаридов N. muscorum. Обнаружено активное и избирательное выделение полисахаридов N. muscorum во внешнюю среду в условиях кадмиевого стресса. Впервые установлено, что кадмий индуцирует усиление экскреции полисахаридов, состав которых отличается от такового в отсутствие кадмия:

доминирующим моносахаридом становится глюкозамин, который легко присоединяет ионы Cd2+.

Обнаружено, что при концентрации кадмия 10-4М, не влияющей на скорость роста и морфологию цианобактерии, перенос энергии от ФС2 к ФС1 усиливается одновременно с активацией защитных механизмов от кадмия, тогда как при концентрации Cd2+ 10-3 М, инициирующей отмирание клеток, перенос энергии между фотосистемами сильно уменьшается.

Обнаружена высокая Cd-связывающая способность R-фикоэритрина. Впервые для стабилизации наночастиц CdS использован фикоэритрин. Выяснено влияние условий синтеза на размер и свойства наночастиц.

Из слизистой оболочки N. muscorum выделены бактерии устойчивые к токсическому воздействию кадмия. Они способны выделять сероводород и связывать кадмий. На основании сравнительного филогенетического анализа с использованием последовательностей генов 16S рРНК, установлено, что выделенный штамм относится к виду Stenotrophomonas maltophilia.

Практическая значимость. Полученные результаты значительно расширяют современные представления о защитных механизмах N. muscorum от высоко токсичных ионов Cd2+ и могут быть полезны при разработке биотехнологических методов очистки промышленных сточных вод и городских водоемов от тяжелых металлов.

Обнаруженное свойство R-фикоэритрина быстро и в больших количествах связывать ионы Cd2+ может быть использовано в терапии острых и хронических отравлений кадмием.

Предложен новый способ стабилизации наночастиц CdS при помощи Rфикоэритрина. Полученные результаты могут быть использованы в разработке лекарственных препаратов и открывают новые возможности для Cd-нейтронозахватной терапии.

Способность S. maltophilia образовывать сульфид и связывать ионы кадмия представляет интерес в связи выяснением механизмов биосинтеза наночастиц со свойствами неорганических полупроводников; использования их в качестве флуоресцентных меток в биологических системах; важна для оценки вклада микроорганизмов в трансформацию соединений тяжёлых металлов и детоксикацию окружающей среды.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 191 страницах машинописного текста, включает 72 рисунка и 10 таблиц. Список литературы включает 303 наименований, в том числе 235 зарубежных изданий.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на научных конференциях:

• Автотрофные микроорганизмы. К 75-летию со дня рождения академика Елены Николаевны Кондратьевой. Московский Государственный Университет им. М.В.

Ломоносова, биологический факультет. 2000.

• International conference 'Primary Processes of Photosynthesis in Bacteria and Plant Photosystem II' and traditional XVII th' Pushcheno Readings in Phosynthesis'. 2002.

• International Symposium Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants With Technogenic Enviromental Pollutants. Saratov. 2003.

• Динамика и структура в химии и биологии. Всероссийская Школа-Симпозиум.

Институт химической-физики им. Н.Н. Семенова РАН. 2004.

• XIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2005), Черноголовка, 2005.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ (5 статей и 5 тезисов докладов).

Материалы и методы исследования Объекты исследования: Штамм ВКМ-16 N. muscorum, полученный из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, культивировали на минеральной среде Кратца-Майерса (КМ) (Kratz, Myers, 1955) при 28 °С, непрерывном поступлении воздуха, обогащенного СО2, освещённости 6000 люкс, pH 7.5. Начальный объём среды с концентрацией N. muscorum 2 ± 0.2 мг сухой биомассы/ мл составлял ~ мл. От случайных бактериальных загрязнений культура была предварительно очищена фильтрованием через мембранный фильтр "Synpor" (диаметр пор 1,5 мкм) в сочетании с промыванием стерильной средой и воздействием ультразвуком в течение 15 секунд с последующей фильтрацией и пересевом на 1,4% агаризованную среду КМ.

Бактерии-спутники выращивали на среде с добавлением глюкозы и пептона по 1 г/л (КМсп), для выращивания микроорганизмов на твердой среде вносили агар – 14 г/л.

Бактериальные загрязнения N. muscorum определяли по окрашиванию ДНК флуоресцентным красителем DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindole) (Whittaker et al., 1991).

Препараты просматривали под эпифлуоресцентным микроскопом.

Бактерии-спутники N. muscorum выделяли из слизистой оболочки: а) накопительной неочищенной культуры; б) культуры после освобождения её от случайных бактериальных загрязнений; в) культуры N. muscorum инкубированной с 10-2 М, 10-3 М и 10-4 М Cd(NO3)в течение 2 месяцев. Для посева на чашки Петри отбирали по 0.5 мл соответствующей культуры, растирая шпателем, и этим же шпателем делали посев на вторую чашку Петри.

Отбирали колонии бактерий, рост которых по штриху был визуально однороден.

Морфологическую однородность выделенных культур контролировали микроскопированием. Из пробирок со скошенным агаром штаммы пересевали в жидкую среду, отмечали характер роста и делали посев на чашки Петри. Чистоту выделенных культур контролировали по однородности выросших колоний.

Видовую принадлежность выделенных штаммов бактерий-спутников определяли по филогенетическому положению микроорганизмов на основании секвенирования гена 16S рРНК в Центре «Биоинженерия» РАН. ДНК выделяли из бактерий согласно методу (Булыгина и др., 2002). Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК пользовались универсальной праймерной системой (Edwards et al, 1989).

Выделение экзополисахаридов из культуральной среды. Отбирали пробу, добавляли 96%-ный этанол в отношении 1:1 для осаждения полисахарида. Через 1 сутки пробы центрифугировали при 15000 об/мин в течение 10 мин. Осадок трижды промывали этанолом при центрифугировании (10 мин, 15000 об/мин) и растворяли в дистиллированной воде.

Концентрацию экзополисахаридов определяли методом Дюбуа, основанным на появлении желто-оранжевого окрашивания при добавлении фенола и серной кислоты к моно-, олиго- или полисахаридам (Dubois et al., 1956).

Состав экзополисахаридов определяли по спектрам поглощения гидролизованного полисахарида (Ikawa, Niemann, 1949). Разложение на компоненты спектров поглощения гидролизованных экзометаболитов осуществляли, как описано в работе (Литвин, Гуляев, 1969).

Выделение сероводорода определяли на жидкой среде по потемнению индикаторной бумаги с ацетатом свинца (Егоров, 1995) и по потемнению среды Kliger агар (Kligler, 1918).

Гистохимическое определение ионов кадмия выполняли по реакции с дитизоном (Серёгин, Иванов, 1997).

Концентрацию ионов кадмия в среде определяли двумя методами. 1) Потенциометрически в присутствии 0,1 М NaNO3 с помощью рН/мВ-метра ("Эксперт001", Россия), в котором измерительным электродом был ион-селективный электрод для кадмия "Эком-Cd". Диапазон линейности электродной функции Cd-селективного электрода 10-7 М – 10-2 М Cd2+ при рН 6,0. Крутизна электродной функции 26,5 мВ при 20 °С.

2) На атомно-эмиссионном спектрофотометре с индуктивно-связанной плазмой “IRIS Advantage” фирмы “Thermo Jarrel Ash” (США). Длина волны измерения 228,802 нм.

Скорость подачи раствора 1,85 мл/мин. Мощность плазмы 1150 Вт.

Синтез наночастиц CdS на R-фикоэритрине включал: связывание ионов кадмия фикоэритрином, синтез сульфида кадмия и фракционирование частиц. Кадмийфикоэритриновый комплекс получали при добавлении Сd(NO3)2 в концентрации от 10-5 М до 10-2 М к 1,8·10-6 М раствору R-фикоэритрина. Образование комплекса Cd2+ c Rфикоэритрином обнаруживали по тушению флуоресценции R-фикоэритрина и по снижению концентрации свободных ионов Cd2+ в среде. Синтез CdS инициировали добавлением 0,3 М Na2S к Cd2+-фикоэритриновому комплексу. Количество сульфида варьировали от 3,0 до 60 мМ. Через 30 мин инкубирования при комнатной температуре препарат центрифугировали в течение 10 мин при 8 °С и 3000 g.

Размер наночастиц CdS определяли по спектрам поглощения и по электронным микрофотографиям.

Электронно-микроскопические исследования проводили совместно с д.г-м.н. В.Т.

Дубинчуком в просвечивающем электронном микроскопе BS-540 (Чехия) с приставкой РЭМ-201 для микрозондового анализа. При этом использовали германий-литиевый детектор при напряжении 25 кВ. Счет в зоне возбуждения 1000 имп/мин, площадь зоны возбуждения варьировали в пределах 2-10 мкм2. Препараты для просвечивающей электронной микроскопии, микрорентгеноспектрального и микродифракционного анализа готовили испарением небольшой капли образца на поддерживающей медной сетке.

Капиллярный электрофорез выполняли на приборе «Капель 103Р» (Россия) в 0,1 мМ трис-буфере с добавлением 0,3 % полидиаллилдиметиламмоний хлорида, рН 8,2.

Внутренний диаметр капилляра 75 мкм, эффективная длина 50 см, общая длина 60 см.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»