WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Изложение результатов диссертационной работы составляет содержание последних трех глав (главы III–V) и построено следующим образом. Глава III носит "инструментальный" характер: она содержит подробное описание свойств кислород- и pH-чувствительных спиновых меток, анализ возможности их применения в исследованиях фотосинтеза и некоторые полученные с их помощью результаты, относящиеся к наиболее простым модельным фотосинтетическим системам — изолированным хлоропластам класса Б.

Глава IV (и дополняющее ее Приложение 3) описывает исследования интактных фотосинтетических систем, в которых находят свое применение некоторые из исследованных в предыдущей главе спиновых меток. Каждому из исследуемых интактных фотосинтетических объектов — цианнобактериям и листьям древесных растений — посвящен отдельный раздел главы. В первом разделе, посвященном цианобактериям, исследуются изменения их биофизических характеристик под действием контролируемого влияния на фотосинтетический аппарат (с использованием ряда мутантов и методов ингибиторного анализа). На полученные при этом результаты отчасти опирается содержание второго раздела, в котором описывается вторая интактная система — листья древесных растений, произрастающих в разных условиях городской среды обитания. Главная задача этого раздела — анализ состояния фотосинтетического аппарата этих растений на основании наблюдаемых изменений (под действием антропогенных влияний) их биофизических характеристик. Последняя Глава V, хотя и посвящена исследованиям, выполненым на изолированной системе (на изолированных хлоропластах класса Б), однако предметом исследований является взаимодействие фотосинтетического аппарата с природным пигментом (амарантином), который, возможно, играет роль в регуляции фотосинтетических процессов in vivo в растениях порядка Centrospermae (Кононков, Гинс, 1997). Опишем теперь подробнее содержание каждой из глав III–V.

Глава III посвящена описанию результатов исследований свойств кислород- и pH-чувствительных спиновых меток и их взаимодействия с хлоропластами; глава содержит 7 разделов.

Раздел III.1 содержит описание физико-химических свойств pHчувствительных спиновых меток, приведенных на рис.1. Приведены спектры меток в буферных водных растворах, зависимости параметров спектров ЭПР от pH и от концентраций меток. Исследовано влияние кислорода и некоторых солей на спектры ЭПР нитроксильных радикалов.

В разделе III.2 описано взаимодействие pH-чувствительных спиновых меток с хлоропластами: окислительно-восстановительные превращения спиновых меток при взаимодействии с хлоропластной ЭТЦ, фотоиндуцированное поглощение молекул метки тилакоидами, фотоиндуцированное связывание и диссоциация молекул метки с тилакоидной мембраной. Показана связь между фотоиндуцированным поглощением, интенсивностью редокс-превращений и величиной pKa метки. Показано, что метки ATI, NTI и ANT-3 не оказывают заметного разобщающего действия на тилакоидные мембраны в концентрациях, используемых для измерений внутритилакоидного pH ( 3 мМ).

Основные результаты, касающиеся кислород-зависимых изменений спектров ЭПР pH-чувствительных спиновых меток в хлоропластах, вынесены в отдельный раздел III.3. Основные исследования выполнены на метке ANT-3, для которой исследовано влияние разнообразных факторов на кинетику фотоиндуцированных изменений величины ее сигнала ЭПР в хлоропластах:

влияние условий газообмена и активных форм кислорода, режима функционирования ЭТЦ, концентрации метки и содержания активно функционирующих ЭТЦ в суспензии. В результате было показано, что в условиях наших экспериментов главную роль в изменении спектра метки играют следующие факторы:

1) редокс-превращения молекул спиновой метки при их взаимодействии с ЭТЦ хлоропластов, приводящие к потере молекулами метки парамагнитных свойств;

2) влияние кислорода как парамагнитного уширителя спектра ЭПР при низких значениях мощности СВЧ (PСВЧ < 10 мВт);

3) влияние кислорода как парамагнитного «релаксатора» при высоких значениях мощности СВЧ (PСВЧ > 10 мВт);

4) концентрационно-зависимые изменения спектра метки, обусловленные фотоиндуцированным перераспределением молекул метки между компартментами хлоропластов (поглощение молекул метки тилакоидами).

Рис. 2. Кинетика фотоA'эксперимент A'индуцированных изменений (у.е.) амплитуды (A'1) низкоHmax полевой компоненты 3235 спектра ЭПР спиновой метки ANT-3 в хлоро пластах: 1 — контроль, PСВЧ = 1 мВт; 2 — контроль, PСВЧ = 100 мВт; 3 — в присутствии NH4Cl, PСВЧ = 1 мВт; 4 — в присутствии NH4Cl, PСВЧ = 100 мВт; 5 — в присутствии каталазы, ANT-PСВЧ = 1 мВт. Концентрация метки — 1 мМ, концентрамодель ция хлоропластов соответствует 1 мкМ P700.

Вертикальными стрелками показаны моменты включения и выключения белого света.

0 60 120 180 240 время, с Вклад каждого их этих факторов в фотоиндуцированные изменения спектра спиновой метки различен для разных меток и определяется интенсивностью ее взаимодействия с ЭТЦ хлоропластов, степенью уширяющего и "релаксаторного" влияния кислорода при разных его концентрациях, а также трансмембранной разностью pH, скоростью переноса электронов по ЭТЦ и активностью хлоропластной каталазы. Для количественного определения перечисленных характеристик метки и ее взаимодействия с хлоропластами на основании наблюдаемых в эксперименте фотоиндуцированных изменений величины сигнала ЭПР метки, мы разработали простую математическую полуэмпирическую модель, учитывающую влияние всех перечисленных выше факторов на величину сигнала ЭПР спиновой метки. Описанию этой модели и полученных с ее помощью результатов посвящен раздел III.4. Показано, что в хлоропластах класса Б, выделяемых по используемой нами методике, при освещении происходит уменьшение концентрации растворенного молекулярного кислорода (за счет неполного разложения перекиси водорода, образующейся в ходе псевдоциклического электронного транспорта) за характерное время ~ 50– 100 с при концентрации хлоропластов, соответствующей ~ 1 мкМ P700. В темноте наблюдается "регенерация" кислорода (по-видимому, за счет действия хлоропластной каталазы) с характерным временем ~ 50–100 с. Наилучшее соответствие модельных кривых экспериментальным достигается при величине pH ~ 3, причем характерное время образования pH на свету составляет 4–7 с, а время рассеяния pH в темноте — ~10 с. Добавление в суспензию разобщителя (NH4Cl) ускоряет восстановление метки в 3–5 раз; примерно во столько же ускоряется и фотоиндуцированное поглощение кислорода.

Типичные экспериментальные и модельные кинетические кривые для метки ANT-3 приведены на рис. 2.

В разделе III.5 суммируются данные, полученные по физикохимическим свойствам исследованных нами спиновых меток (ANT-1, ANT-2, ANT-3, ANT-4, ANT-5, ANT-8, ATI, NTI) и их взаимодействию с хлоропластами, описанные в предыдущих разделах данной главы, и делаются выводы о возможности их применения для измерения pH внутри тилакоидов (pHin). Так, pH-чувствительные спиновые метки ANT-1, ANT-2, ANT-3, ATI, обладающие значениями pK ниже 6,5-7,0, являются наиболее перспективными для измерений pHin по эффекту pH-зависимого изменения формы спектра метки при ее протонировании/депротонировании. Спектры ЭПР этих меток наименее подвержены искажениям за счет быстрой потери молекулами метки ее парамагнитных свойств и/или эффекта концентрационного уширения при перераспределении метки внутри хлоропласта. Метки ANT-4, ANT-5, ANT-8, NTI, обладающие значениями pK 7, имеют спектры ЭПР, которые могут заметно искажаться в результате концентрационного уширения и потери парамагнетизма. Тем не менее, для этих меток также наблюдаются фотоиндуцированные изменения их спектров в хлоропластах. Поглощение этих меток хлоропластами, когда их концентрация внутри тилакоидов возрастает не более, чем 10 раз, еще не сопровождается заметным искажением формы спектра из-за эффекта концентрационного уширения. Таким образом, используя эти метки, можно измерять значения внутритилакоидного pH по pHзависимым изменениям спектров ЭПР.

Применению изученных нами спиновых меток к измерениям pH внутри тилакоидов посвящен следующий раздел III.6. С использованием спиновых меток ANT-3, ANT-4 и ANT-5, в присутствии парамагнитного уширителя CrOx в среде в концентрациях 8–16 мМ, показано, что при освещении изолированных хлоропластов класса Б происходит закисление внутритилакоидного пространства; образующаяся при этом величина pH > 2–2,5. Спектры ЭПР внутритилакоидной фракции метки приведены на рис. 3.

ANT-ANT-4 ANT- Свет Темнота Свет Темнота Свет Темнота (Хлоропласты) pH = 6,pH = 5,pH = 5,pH = 8,pH = 7,pH = 5,pH = 5, (Буфер) 3262 3266 3270 3262 3266 3270 3262 3266 H (Э) H (Э) H (Э) Рис.3. Спектры ЭПР спиновых меток ANT-3, ANT-4 и ANT-5: вверху — внутренний сигнал в хлоропластах, в темноте и при освещении ( >15 с), в присутствии каталазы и метилвиологена; внизу — в буферных растворах при разных значениях pH. Концентрации меток — 1 мМ, концентрация хлоропластов соответствует ~5 мкМ P700. Мощность СВЧ-излучения — 10 мВт.

Последний раздел III.7 данной главы посвящен кислородчувствительной спиновой метке CxTPO. Спектр ЭПР данной метки обладает суперсверхтонкой структурой (суперСТС), хорошо разрешенной в анаэробных условиях (см. рис. 4). Изучена зависимость формы спектра от концентрации кислорода и концентрации самой метки, выбраны параметры спектра, чувствительные к концентрации кислорода и построены калибровочные зависимости. Показано, что в изолированных хлоропластах > 90% кислорода, растворенного в среде, поглощается за время 15 с (при 1 мкМ P700). В темноте происходит "регенерация" молекулярного кислорода за время < 70– 150 с, что согласуется с данными, полученными при построении математической модели кинетики изменения величины сигнала ЭПР спиновых меток, описанной в разд. III.4.

а Аргон a Рис. 4. Спектры ЭПР спиновой Воздух метки CxTPO: а — в буфере, в b Буфер атмосфере аргона и в равновесии с воздухом; б — в суспензии цианобактерий = a/b Synechocystis sp. 6803, помещенной в газонепроницаемую кварцевую кювету, в темноте и на свету. Концентрация Свет б метки 0,1 мМ, амплитуда ВЧ(1 мин.) модуляции магнитного поля Темнота Hm = 0,025 Гс.

Цианобактерии HСвет (3 мин.) H3234 3235 3236 H (Э) Глава IV посвящена исследованиям фотосинтетического электронного транспорта в интактных фотосинтетических системах: в листьях древесных растений и в цианобактериях.

В разделе IV.1 описаны результаты исследований процессов фотосинтетического и дыхательного электронного и протонного транспорта, протекающих в тилакоидных мембранах цианобактерий. Наше внимание было сосредоточено, главным образом, на решении следующих вопросов:

1) какие факторы, в первую очередь, контролируют электронный транспорт (ЭТ) в тилакоидных мембранах цианобактерий 2) Достигается ли при нормальной работе электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) тилакоидной мембраны цианобактерий состояние дыхательного и/или фотосинтетического контроля Если да, то какова величина коэффициента дыхательного (фотосинтетического) контроля 3) Какой вклад в вносят в трансмембранный протонный потенциал электрическая и концентрационная составляющие 4) Какие комплексы вносят основной вклад в суммарный ЭТ на различных участках тилакоидных ЭТЦ (дегидрогеназы, ФС 2, оксидазы, ФС 1) P P 0. 100 0.50 0.0.0 0.0 0.10 15 6 8 10.0 10.5 11.время, мин. время, мин.

Рис. 5. Фотоиндуцированные изменения величины сигнала ЭПР I (P) и параметра (см. определение на рис. 4) спектра ЭПР спиновой метки CxTPO, инкубируемой в суспензии цианобактерий Synechocystis sp. (дикий тип): вверху — клетки, подвергавшиеся заморозке, с добавлением глицерина; внизу — клетки, не подвергавшиеся заморозке. Темновая адаптация — 10 мин. Момент включения света показан вертикальной стрелкой.

Основные исследования были выполнены на клетках цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 дикого типа, а также мутантных штаммов SDH–, NDH-ABC–, NDb–, OX–, PS2–, не имеющих одного или нескольких компонентов дыхательной или фотосинтетической ЭТЦ (сукцинатдегидрогеназы, NADH дегидрогеназ 1 или 2, терминальных оксидаз или фотосистемы 2, соответственно). Было показано, что:

1) фотосинтетический электронный транспорт контролируется протонным потенциалом и скоростью оттока электронов на акцепторной стороне ФС 1; роль последнего фактора становится решающей в анаэробных условиях. При этом наблюдается корреляция между фотоиндуцированными процессами окисления P700 в ФС 1 и выделения кислорода в ФС 2 (рис. 5).

2) Коэффициенты дыхательного и фотосинтетического контроля (замедление электронного транспорта из-за образования трансмембранного протонного потенциала, измеренное в темноте и на свету, соответственно) составляют ~ 2,0 и ~ 2,8, соответственно (раздел IV.1.5) (см. рис. 6) WT OXконтроль CCCP 0.CCCP 0.контроль 0.05 10 0 10 20 25 H(Э) WT OX2.контроль контроль 1.CCCP CCCP 1.0 5 10 15 20 25 0 10 20 25 30 время, мин.

время, мин.

Рис. 6. Изменение параметров и H1 (определения и H1 см. на рис. 4) спектра ЭПР спиновой метки CxTPO, инкубируемой в суспензии цианобактерий Synechocystis sp. 6803, дикого типа (слева) и OX– мутанта (справа), не подвергавшихся заморозке, в кварцевой кювете. Освещение белым светом — в течение 6 мин (моменты включения и выключения света показаны вертикальными стрелками). Концентрация CCCP — 80 мкМ.

3) Основной вклад в протонный потенциал, влияющий на скорость дыхания, вносит его концентрационная составляющая рН (раздел IV.1.5).

4) Основной вклад (до 80%) в приток электронов в цепь переноса между двумя фотосистемами со стороны дыхательной цепи в темноте вносит SDH. В условиях освещения относительный вклад циклического транспорта электронов в суммарный поток электронов к Р700+ составляет ~30-60% от полного потока электронов, включающего поток электронов от ФС 2. (раздел IV.1.3).

5) Основной вклад в электронный транспорт на участке ЭТЦ после PQ вносит ФС 1, вклад терминальных оксидаз тилакоидной мембраны в условиях освещения практически незаметен ( > 10%) (раздел IV.1.4).

6) Поглощение кислорода клеткой подавляется цианидом (20 мМ) на ~85%. Неспецифическое поглощение кислорода, сохраняющееся в отсутствие терминальных оксидаз, составляет менее 5% (раздел IV.1.2).

Раздел IV.2 посвящен исследованиям фотосинтетических характеристик древесных растений, произрастающих в естественных условиях в черте города.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»