WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова _ Физический факультет

На правах рукописи

УДК 577.3 Птушенко Василий Витальевич ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОННОГО И ПРОТОННОГО ТРАНСПОРТА В ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ОКСИГЕННОГО ТИПА С ПОМОЩЬЮ СПИНОВЫХ МЕТОК 03.00.02 – биофизика 03.00.16 – экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва – 2006 г.

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор Тихонов Александр Николаевич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куставич кандидат биологических наук, доцент Тимофеев Кирилл Николаевич

Ведущая организация: Институт Химической Физики РАН им. Н.Н. Семенова

Защита диссертации состоится «27» апреля 2006 года в _ часов на заседании диссертационного совета К 501.001.08 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, физический факультет, Малая физическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан _ 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета К 501.001.08.

кандидат физико-математических наук Г.Б. Хомутов 1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Открытие электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) Евгением Константиновичем Завойским в 1944 г. (Альтшулер и др., 1944; Завойский, 1944–1945; Zavoisky, 1945–1946), дало науке новый мощный метод исследования, который благодаря пионерским работам Б. Коммонера (Commoner et al., 1954) и Л.А. Блюменфельда (Блюменфельд, 1957;

Блюменфельд и Калмансон, 1957) вошел в биологию и в последние полвека является одним из основных биофизических методов исследования.

Появившийся в 1960-х гг. благодаря работам А.Б. Неймана, Х. Мак-Коннела, А.Л. Бучаченко, А.Н. Кузнецова, Г.И. Лихтенштейна метод спиновых зондов (или спиновых меток), основанный на явлении ЭПР, сделал возможным исследование биологических систем на самых разных уровнях их структурной и функциональной организации.

Одной из наиболее актуальных задач современной биофизики является измерение pH среды в микрообъемах. В биоэнергетике точное измерение pH в микроскопических везикулах митохондрий или внутрихлоропластных образований — тилакоидов — связано с разрешением двух принципиальных вопросов: а) какой механизм сопряжения — локальный или нелокальный — обеспечивает синтез ATP в энергетических органеллах клетки, и б) какова относительная роль двух составляющих трансмембранного протонного потенциала в этом синтезе. Измерение pH с помощью pH-чувствительных спиновых меток уже более 20 лет используется в различных областях химии, биологии и медицины, однако в исследованиях процессов фотосинтеза pHчувствительные спиновые метки до сих пор не получили должного применения. Измерение pH в микроскопических объемах тилакоидов, содержащих реакционноспособные компоненты электрон-транспортной цепи (ЭТЦ), требует разработки специальных методов регистрации и обработки спектров ЭПР спиновых меток и подбора подходящих условий измерений (Trubitsin & Tikhonov, 2003; Tikhonov & Subczynski, 2005). В последние годы было синтезировано большое количество новых pH-чувствительных спиновых меток (Khramtsov et al., 2000; Kirilyuk et al., 2004, 2005; Voinov et al., 2005), обладающих широким спектром физико-химических свойств, что раскрывает широкие возможности для проведения подобных исследований. В связи с этим актуальной задачей для биофизики фотосинтеза является исследование свойств новых pH-чувствительных спиновых меток и возможностей их применения для измерения внутритилакоидного pH в изолированных хлоропластах растений.

Большинство исследований фотосинтеза осуществляется на изолированных фотосинтетических системах: на отдельных изолированных фотосинтетических комплексах либо на препаратах изолированных тилакоидов (или на хлоропластах класса Б). Однако для изучения регуляции световых стадий фотосинтеза и взаимодействие между разными биохимическими системами фотосинтезирующей клетки необходимо исследование интактных фотосинтетических систем. Одной из наиболее удобных интактных фотосинтетических систем оксигенного типа являются клетки цианобактерий.

Примером другой интактной фотосинтетической системы оксигенного типа являются хлоропласты растений in situ, в живом листе. При этом исследование процессов электронного фотосинтетического транспорта в листьях древесных растений, произрастающих в открытом грунте на территории г. Москвы важно не только с точки зрения биофизики фотосинтеза, но имеет также практическую ценность (для охраны окружающей среды).

Цели и задачи работы Основной целью данной работы является изучение электронного и протонного транспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа, в особенности — интактных, а также исследование возможностей применения ряда имидазолиновых и имидазолидиновых кислород- и pH-чувствительных спиновых меток для изучения световых стадий фотосинтеза.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1) изучить физико-химические и биологические свойства ряда новых имидазолиновых и имидазолидиновых спиновых меток, их взаимодействие с хлоропластами и цианобактериями, и разработать алгоритм измерения pH и концентрации кислорода по фотоиндуцированным изменениям спектров ЭПР спиновых меток;

2) изучить (с использованием методов ингибиторного анализа, а также фотосинтетических и дыхательных мутантов цианобактерий Synechocystis sp.

PCC 6803 и Synechococcus sp. PCC 7942), какие факторы контролируют электронный транспорт (ЭТ) в тилакоидных мембранах цианобактерий и какие фотосинтетические и дыхательные комплексы вносят основной вклад в суммарный ЭТ на различных участках тилакоидных цепей транспорта электронов;

3) определить, какие показатели фотосинтеза наиболее чувствительны к загрязненности среды произрастания растений продуктами автомобильных выхлопов, изучить характер изменений этих параметров и выяснить, какие изменения в фотосинтетическом аппарате растений происходят под действием этого антропогенного фактора;

4) изучить механизмы влияния природного пигмента амарантина на процессы транспорта электронов в хлоропластах.

Научная новизна работы Впервые получены сигналы ЭПР ряда имидазолиновых нитроксильных радикалов (ANT-1, ANT-3, ANT-4, ANT-5), локализованных во внутритилакоидном пространстве. Показано, что эти pH-чувствительные спиновые метки могут быть использованы для измерения pH в хлоропластах.

Показано, что скорость оттока электронов от ФС 1 является существенным фактором регуляции электронного транспорта в клетках цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, причем в анаэробных условиях отток электронов от ФС 1 является лимитирующим звеном в работе фотосинтетической цепи переноса электронов. Показана корреляция между фотоиндуцированными процессами окисления P700 в ФС 1 и выделения кислорода в ФС 2. Установлено, что замедление скоростей дыхания (в темноте) и переноса электронов на участке между двумя фотосистемами (в условиях освещения) в клетках цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 обусловлено, в основном, концентрационной составляющей (рН) протонного потенциала.

Определены «кинетические» параметры фотосинтетических процессов в листьях растений, измеряемые методом ЭПР и медленной индукции флуоресценции, чувствительные к условиям произрастания растений, включая неблагоприятные антропогенные факторы внешней среды.

Предложен механизм возможного участия беталаинового пигмента амарантина в реакциях транспорта электронов in vitro.

Практическая ценность Полученные в диссертации данные о физико-химических и биологических свойствах исследованных имидазолиновых и имидазолидиновых спиновых меток могут быть использованы в разнообразных физиологических, биофизических, физико-химических задачах с применением этих меток. Предложенная в диссертации полуэмпирическая модель, описывающая фотоиндуцированные изменения величины сигнала ЭПР метки, может быть в дальнейшем использована для экспресс-оценки свойств новых спиновых меток (эффективность взаимодействия с цепью переноса электронов хлоропластов, стабильность радикальной формы, эффективность парамагнитного взаимодействия молекул метки с кислородом, как с "релаксационным" и "уширяющим" агентом, и т.п.).

Полученные в диссертации данные об изменении биофизических показателей листьев растений, произрастающих вблизи транспортных магистралей, могут быть использованы при организации защитных зеленых насаждений (лесополос), для оценки их эффективности.

Апробация работы и публикации Основные результаты диссертации были представлены на III Всероссийской научной конференции “Физические проблемы экологии (Физическая экология)” (Москва, 1997), на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001", секция "Физика" (Москва, 2001), на IV Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001), на Международной конференции “Актуальные вопросы экологической физиологии растений в XXI веке“ (Сыктывкар, 2001), на XXXV Ежегодном международном съезде "Annual International Meeting: Advanced Techniques and Applications of EPR" (Aberdeen, Scotland, UK, 2002), на Молодежной школеконференции "Современные проблемы биохимической физики" (Москва, 2002), на V Международном съезде Европейской федерации ЭПР "Meeting of the European Federation of EPR Groups" (Lisbon, Portugal, 2003), на XIII Европейской биоэнергетической конференции EBEC (Pisa, Italy, 2004).

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 290 стр., содержит 97 рис. и 3 табл. (в т.ч.

20 стр., 14 рис. в приложениях), список литературы содержит 146 библиографических ссылок. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы и трех приложений.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и основные задачи работы.

Глава I диссертации представляет собой обзор литературы, который состоит из двух частей. В первой части приведены современные данные о световых стадиях фотосинтеза и структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата цианобактерий и хлоропластов высших растений.

Проведено сравнение электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) хлоропластов и цианобактерий. Рассмотрены данные о взаимодействии фотосинтетической и дыхательной ЭТЦ в клетках цианобактерий и высших растений, о компонентном составе хлоропластной и цианобактериальных ЭТЦ, о соотношении активностей и локализации отдельных компонент, о пространственной организации фотосинтетического и дыхательного аппаратов.

Особое внимание уделено анализу возможных путей электрона в ходе энергодонорных элетрон-транспортных процессов (нециклический, псевдоциклический, "короткий" и "длинный" циклические пути) и механизмов регуляции электронного и протонного транспорта в цианобактериях и хлоропластах.

Вторая часть Главы I посвящена применениям кислород- и pHчувствительных спиновых меток в исследованиях фотосинтеза. Проведено сравнение различных методов измерения pH внутри тилакоидов, основанных на применении спиновых меток.

Глава II посвящена описанию материалов и методов, использованных в диссертационной работе. Объектами исследования служили следующие фотосинтетические системы:

• изолированные хлоропласты бобов (Vicia faba L., сорт «Русские черные»), амаранта (Amaranthus tricolor L., сорт «Валентина») и шпината (Spinacia oleracea L., сорт «Стоик»);

• цианобактерии Synechocystis sp., strain PCC 6803, дикий тип и мутанты PSIIless (без ФС 2), OX-less (без терминальных окисдаз), SDH-less (без SDH), NDHABC-less (без NDH-1) и NDb-less (без NDH-2); Synechococcus sp., strain PCC 7942, дикий тип и мутант FTN2 (обладающий длинными клетками);

• листья бобов (Vicia faba L., сорт «Русские черные»), пшеницы (Пшеница мягкая, Triticum aestivum L.) и древесных растений нескольких видов (Клен платановидный, Acer platanoides L., Клен американский, A. negundo L., Рябина обыкновенная, Sorbus aucuparia L., Липа мелколистная, Tilia cordata L.).

N NH N N N N N N N N N N O O O O N ANT-1 ANT-2 ANT-ANT-(KG-2)1 (KG-1)1 (KG-4)(HMI)N NON N H2N N N N NH N N N N O O O O ANT-ANT-8 ATI NTI (KG-5)(KG-3)1 (SL-11)3 (SL-7)NH3+ COOH 4 3 N 2 N N N N 1 O O O O TA CxTPO Рис. 1. Кислород- и pH-чувствительные нитроксильные радикалы. Обозначения введены в (Птушенко, 2002). В скобках приведены синонимы, 1 встречающиеся в литературе: — (Tikhonov e.a., 2003), — (Foster e.a., 2003), — (Khramtsov & Volodarsky, 1998).

Кинетику фотосинтетического транспорта электронов во всех исследуемых объектах изучали по фотоиндуцируемым изменениям величины сигнала ЭПР I от окисленных реакционных центров ФС 1 (P700+). Для анализа работы ФС 2 и комплексов дыхательной ЭТЦ цианобактерий измеряли концентрацию кислорода в среде полярографическим методом и методом ЭПР с помощью кислород-чувствительной спиновой метки CxTPO (см. рис. 1). Для измерения внутритилакоидного pH в хлоропластах использовали pH чувствительные спиновые метки, приведенные на рис. 1. Спектры внутритилакоидной фракции молекул метки вычленяли с помощью непроникающего через мембрану парамагнитного уширителя оксалата хрома (CrOx). Измерение скорости фосфорилирования в изолированных хлоропластах проводили pH-метрическим методом (по защелачиванию среды при синтезе ATP). Целостность тилакоидных мембран хлоропластов проверяли по эффекту фотоиндуцированого уширения спиновой метки TA, поглощаемой тилакоидами в ответ на закисление внутритилакоидного пространства. Целостность хлоропластной мембраны проверяли по фотоиндуцированному восстановлению феррицианида хлоропластами, которая также измерялась pH-метрически (по защелачиванию среды при восстановлении феррицианида).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»