WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Рис.8 Ренатурация люциферазы, денатурированной нагреванием.

Связанную с рибосомой в виде пептидилтРНК (1) или освобожденную из рибосомы в раствор в ходе пуромициновой реакции (2) люциферазу денатурировали в буферном растворе при 40°С в течение 20 минут. В таких же условиях денатурировали белок дикого типа (3). Для инициации сворачивания температуру реакционной смеси понижали до 25°С. Концентрация фермента составляла 8 нМ во всех опытах. Активность неденатурированного фермента принята за 100%.

Ренатурация термически денатурированной люциферазы происходила медленно: уровень плато не был достигнут в течение 5 часов инкубации ни в случае белка, связанного с рибосомой в виде пептидил-тРНК, ни в случае свободного белка, сворачивающегося в растворе (рис. 8, кривые 1 и 3). В то же время связанная с рибосомой люцифераза сворачивалась с большей эффективностью, чем фермент дикого типа в растворе: после 5 часов инкубации выход активного белка составил 20% и 6%, соответственно.

Очевидно, что это различие вызвано исключительно иммобилизацией фермента на рибосоме, поскольку его освобождение в раствор с помощью пуромициновой реакции снижает эффективность ренатурации белка с 20 до 8% (рис. 8, кривая 2). Таким образом можно заключить, что иммобилизация С конца люциферазы на рибосоме (так же, как и на гранулах сефарозы) увеличивает эффективность её сворачивания из денатурированного состояния, но не обеспечивает высокой скорости этого процесса, наблюдаемой при котрансляционном сворачивании.

Глава IV. Влияние скорости синтеза полипептидной цепи люциферазы на её котрансляционное сворачивание При котрансляционном сворачивании синтез белка сопряжён по времени с формированием его третичной структуры. Можно ожидать, что скорость синтеза полипептидной цепи влияет на сопряжённое с ним сворачивание.

Чтобы проверить это предположение, было использовано два способа варьирования скорости синтеза люциферазы в бесклеточной системе трансляции. Первый заключался в синтезе фермента в обычном экстракте при разной температуре, второй основывался на использовании для синтеза специального экстракта, в котором можно варьировать концентрацию фактора элонгации G (EF-G) и, тем самым, менять скорость элонгации полипептидной цепи. Оба подхода были использованы для выявления зависимости эффективности котрансляционного сворачивания люциферазы от скорости её синтеза на рибосоме.

4.1. Влияние температуры на эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы Известно, что скорость химических реакций (как спонтанных, так и катализируемых ферментами) зависит от температуры. Процесс биосинтеза белка состоит из ряда реакций, и также должен зависеть от температуры. Для выявления вида этой зависимости мРНК люциферазы транслировали в бактериальной бесклеточной системе при 16, 20, 25, 30, 35 и 40°С. Скорость синтеза фермента оценивали по времени появления люминесценции в реакционной смеси, поскольку в начале инкубации активный фермент отсутствует в транслирующей системе. Как следует из рис. 9, увеличение температуры инкубации приводит к более быстрому появлению активной люциферазы в системе. Так, люциферазная реакция наблюдается уже после минут инкубации при 40°С, в то время как при 16°С – только после 20 минут.

При всех значениях температуры инкубации, опробованных в опыте, появление люциферазной активности коррелирует по времени с появлением полноразмерных молекул фермента в трансляционной системе (рис. 9, радиоавтографы гелей ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле). Можно заключить, что скорость синтеза полипептидной цепи возрастает с увеличением температуры.

Чтобы установить, зависит ли эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы от температуры, при которой происходит её синтез, определяли удельную активность фермента, синтезированного при разной температуре. Удельную активность белка подсчитывали как отношение ферментативной активности люциферазы, измеренной при 25°С, к количеству полноразмерного меченого белка (рис. 10). Видно, что зависимость эффективности котрансляционного сворачивания белка от температуры, при которой происходит его синтез, имеет "колоколообразный" вид. Самые большие значения удельной активности люциферазы наблюдаются в интервале температур от 25 до 30°C, а самые низкие – при 16°C и 40°С.

Рис.9 Бесклеточный синтез люциферазы при разной температуре. Синтез белка проводили в присутствии [14C]лейцина при указанной температуре. Аликвоты отбирали из транслирующих систем в указанное под радиоавтографом время и разбавляли их буферным раствором, содержащим АТФ, люциферин и тиострептон.

Активность люциферазы в аликвотах измеряли с помощью люминометра при 25°С (графики представлены слева). Радиоактивно меченые продукты трансляции в аликвотах анализировали с помощью ДСН-электрофореза в 10% полиакриламидном геле и радиоавтографии (радиоавтографы представлены справа). Положение полосы полноразмерной люциферазы указано стрелкой.

Рис.10 Зависимость удельной активности люциферазы от температуры, при которой происходил синтез фермента. (а) удельная активность люциферазы, синтезированной при определённой температуре (указана на оси абсцисс, под соответствующей группой слитых столбцов). Отдельный столбец в группе (в порядке слева направо) представляет величину удельной активности, измеренной на 30, 40, 50 и 60 минутах трансляции, соответственно. (б) Усреднённая по времени синтеза удельная активность в зависимости от температуры, при которой синтезировали фермент.

4.2. Влияние скорости синтеза люциферазы на эффективность её котрансляционного сворачивания Зависимость эффективности котрансляционного сворачивания люциферазы от температуры может быть объяснена не только влиянием скорости синтеза полипептидной цепи на её сворачивание. Как было показано выше, люцифераза является термолабильным белком. Поэтому низкая удельная активность фермента, синтезируемого при высокой температуре, может быть обусловлена его тепловой денатурацией. Низкие же температуры должны приводить к снижению гибкости полипептидной цепи и замедлению её сворачивания, что также может сказаться на удельной активности люциферазы.

Для того чтобы установить, зависит ли эффективность котрансляционного сворачивания именно от скорости синтеза белка, была разработана бесклеточная система трансляции, в которой скорость элонгации полипептидной цепи можно варьировать при постоянной температуре.

Скорость элонгации зависит от многих факторов, и, в частности, от активности фактора элонгации G (EF-G), белка, катализирующего рибосомную транслокацию. В группе М.Г. Бубуненко (National Cancer Institute, USA) для нас был создан штамм NB5 E. coli, в котором ген EF-G удалён из хромосомы одновременно с введением в клетки плазмиды, содержащей ген мутантного фактора. Последовательность мутантного белка снабжена С-концевым гексагистидиновым трактом, что позволяло избирательно удалять фактор из клеточного экстракта. Ожидалось, что снижение концентрации EF-G в системе трансляции должно замедлить элонгацию полипептидной цепи.

Для удаления фактора G из S30 экстракта клеток штамма NBиспользовали металл-хелатную хроматографию на Ni2+-сефарозе. Связанный с носителем белок элюировали буферным раствором, содержащим 0.5 М имидазол. Элюат, а также не связавшийся с носителем тотальный белок экстракта, анализировали с помощью ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 11). Видно, что обработка Ni2+-сефарозой вызывает обеднение экстракта по единственному белку, электрофоретическая подвижность которого соответствует подвижности EF-G (молекулярный вес 80 кДа). В то же время обработка хелирующей сефарозой экстракта клеток штамма A19, содержащих EF-G дикого типа, не приводила к удалению белков из экстракта (рис. 11).

Рис.11 Белковый состав S30 экстрактов, подвергнутых металл-хелатной хроматографии. Экстракт клеток E. coli штамма NB5 или А19 инкубировали в присутствии Ni2+-сефарозы, носитель отделяли центрифугированием и связанный белок элюировали буферным раствором, содержащим 0.5 М имидазол. Аликвоты экстракта после обработки (1), и элюата (2) анализировали с помощью ДСНэлектрофореза в полиакриламидном геле.

Приведена фотография геля, окрашенного кумасси голубым. Положение полосы полноразмерного EF-G указано стрелкой.

Положение маркеров молекулярной массы и величины их масс указаны слева от электрофореграммы.

В S30 экстракте клеток NB5, обеднённом по EF-G, транслировали мРНК люциферазы. Синтез белка вели при 25°С в присутствии субстратов люциферазы, непрерывно измеряя интенсивность свечения в реакционной смеси. Видно, что обеднение экстракта по фактору G существенно снижает скорость синтеза белка (рис. 12). Время, необходимое для появления активных молекул люциферазы, при этом увеличивается с 6 минут в исходном экстракте (содержащем EF-G в исходной концентрации) до 30 минут в экстракте, обеднённом по EF-G. Также следует отметить, что в обработанном Ni2+сефарозой экстракте количество синтезируемого активного фермента снижено.

Для проверки предположения, что замедление трансляции связано именно со снижением концентрации EF-G, синтез люциферазы проводили, добавляя в обеднённый экстракт высокоочищенный препарат фактора. Как видно на рис.

12, добавление в систему трансляции очищенного EF-G увеличивает скорость синтеза и количество синтезированной активной люциферазы. Так, добавление в экстракт EF-G до концентрации 1 мкМ и 10 мкМ уменьшает время, необходимое для появления люциферазной активности в системе трансляции, с 30 минут до 12 и 7 минут, соответственно. Можно заключить, что наблюдаемое замедление синтеза белка в экстракте, обработанном Ni2+-сефарозой, обусловлено снижением концентрации только EF-G. В дополнительных экспериментах было показано, что снижение концентрации EF-G не изменяет скорости других стадий трансляции – инициации и терминации (данные не приведены). Таким образом, именно замедление элонгации вызывает снижение скорости синтеза белка.

Рис.12 Синтез люциферазы в бесклеточной системе трансляции при разных концентрациях EF-G.

Синтез белка проводили при 25С в системе трансляции, содержащей необработанный S30 экстракт клеток NB5 (1), экстракт, обеднённый по EF-G с помощью Ni2+-хелатной хроматографии (4), или обеднённый экстракт, к которому был добавлен очищенный EF-G до концентрации 1 мкМ (3) и 10 мкМ (2). На врезке вверху представлен фрагмент того же графика в увеличенном масштабе.

Далее была измерена удельная активность люциферазы, синтезированной с разными скоростями. Синтез вели при температуре 30°С в присутствии [14С]лейцина. В заданное время из системы трансляции отбирали аликвоты.

Активность фермента и радиоактивность, включившуюся в его полноразмерную цепь, измеряли, как описано выше (главы 2.2 и 4.1).

Оказалось, что замедление синтеза белка вызывало снижение эффективности сворачивания синтезируемого фермента (рис. 13). Увеличение скорости синтеза с помощью добавления к обеднённому экстракту фактора элонгации приводило к восстановлению удельной активности люциферазы до уровня, наблюдаемого в необработанном экстракте.

На рис. 13б представлена зависимость удельной активности белка от скорости его синтеза. Скорость, выраженную в аминокислотных остатках в секунду, рассчитывали как отношение количества аминокислотных остатков в люциферазной цепи ко времени, необходимому для её синтеза. Видно, что максимальное снижение концентрации EF-G, достигнутое в опыте, приводит к 2-кратному снижению удельной активности синтезируемого белка. Таким образом, выявлена зависимость эффективности котрансляционного сворачивания белка от скорости элонгации его полипептидной цепи. В случае люциферазы снижение скорости приводит к ухудшению сворачивания.

Вероятно, этой же причиной обусловлено снижение удельной активности люциферазы, синтезируемой при низкой температуре.

Рис 13 Удельная активность люциферазы, синтезируемой в бесклеточных системах трансляции с разными концентрациями EF-G. (а) Удельная активность фермента, измеренная в процессе работы системы в указанное время. Системы трансляции содержат исходный экстракт клеток NB5 (1), экстракт, обеднённый по EF-G с помощью Ni2+-сефарозы (4) или обеднённый экстракт, к которому добавлен EF-G до концентрации 1 мкМ (3) и 10 мкМ (2). Синтез фермента проводили при 30°С. (б) Зависимость усреднённой по времени удельной активности люциферазы от скорости элонгации (в аминокислотных остатков в секунду).

ВЫВОДЫ 1. Молекулярные шапероны семейства Hsp70, необходимые для эффективного сворачивания денатурированной люциферазы светлячка Photinus pyralis, не участвуют в котрансляционном сворачивании этого белка.

2. Иммобилизация C конца люциферазы на массивной частице (гранула сефарозы или рибосома) увеличивает эффективность сворачивания этого белка из денатурированного состояния, препятствуя межмолекулярной агрегации.

3. Иммобилизации C конца растущего полипептида на рибосоме недостаточно для обеспечения высокой скорости котрансляционного сворачивания.

4. Эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы зависит от температуры: её оптимальное значение лежит между 25 и 30°С.

5. Эффективность котрансляционного сворачивания зависит от скорости элонгации полипептидной цепи на рибосоме. В случае люциферазы замедление элонгации приводит к снижению удельной активности синтезированного фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Светлов М.С., Колб В.А., Коммер А. и Спирин А.С. (2005) Эффективное котрансляционное сворачивание светлячковой люциферазы не зависит от шаперонов Hsp70. Тезисы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005», Москва, – 15 апреля.

2. Svetlov M.S., Kommer A., Kolb V.A. and Spirin A.S. (2006) Effective cotranslational folding of firefly luciferase without chaperones of the Hspfamily. Protein Sci., 15, 242-247.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»