WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Ренатурацию люциферазы инициировали 50-кратным разбавлением пробы денатурированного мочевиной белка. Для разбавления использовали бесклеточную систему, транслирующую мРНК GFP и содержащую люциферин. Конечная концентрация белка составляла 8.4 нМ.

Ренатурацию проводили при 25°С в отсутствие (–Hsp70) или в присутствии добавленных в систему трансляции шаперонов (+Hsp70). В контрольном эксперименте использовали образец люциферазы, не обработанный мочевиной и разбавленный системой трансляции до конечной концентрации 8.4 нМ (контроль).

2.2. Эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы в присутствии шаперонов HspВлияние шаперонов Hsp70 на эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы оценивали, используя синтез фермента в бактериальных бесклеточных системах трансляции с разным содержанием активных Hsp70. Мерой эффективности сворачивания служила удельная ферментативная активность белка, определяемая как отношение его активности к количеству.

Синтез люциферазы проводили при 25°С в присутствии [14C]фенилаланина. В случае добавления в систему трансляции высокоочищенных шаперонов DnaK, DnaJ и GrpE (димер), их концентрация составляла 1.3 мкМ, 200 нМ и 650 нМ, соответственно. Активность белка измеряли с помощью люминометра (рис. 3а).

Рис.3 Влияние шаперонов Hsp70 на эффективность сворачивания люциферазы, синтезируемой в бесклеточной системе трансляции.

Люциферазу синтезировали в присутствии [14C]фенилаланина в системе трансляции без (–Hsp70) или с добавлением шаперонов DnaK, DnaJ и GrpE (+Hsp70) до концентрации 1.3 мкМ, 200 нМ и 650 нМ, соответственно. Аликвоты, отобранные из трансляционной смеси, разбавляли буфером, содержащим АТФ, люциферин и ингибитор белкового синтеза (тиострептон). (а) Активность люциферазы в аликвотах. (б) Количество полноразмерной люциферазы в этих же аликвотах, определённое с помощью ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле, радиоавтографии и подсчёта радиоактивности в полосе полноразмерного белка с помощью программы OptiQuant. (в) Удельная ферментативная активность люциферазы в аликвотах, определённая как отношение активности фермента к его количеству.

Образцы после измерения люминесценции подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях, и количество полноразмерного белка оценивали по радиоактивности включившейся в него меченой аминокислоты (рис. 3б).

Видно, что количество и активность синтезируемой люциферазы практически не зависят от добавления экзогенных шаперонов. Результат подсчёта удельной активности белка представлен на рис. 3в. Очевидно, что эффективность котрансляционного сворачивания люциферазы (в отличие от её ренатурации) не зависит от активности шаперонов в системе трансляции.

2.3. Длительность пост-трансляционной фазы сворачивания люциферазы, синтезируемой в присутствии шаперонов HspРанее было показано, что синтезируемая de novo люцифераза завершает сворачивание и приобретает структуру активного фермента за чрезвычайно короткий промежуток времени (секунды или менее того) после освобождения из рибосомы. Иными словами, пост-трансляционная фаза сворачивания фермента длится не более секунды. В то же время сворачивание денатурированной люциферазы, катализируемое Hsp70 и осуществляющееся в точно таких же условиях (в бесклеточной системе трансляции), происходит медленно, с характеристическим временем в десятки минут (см. рис.2). Можно было ожидать, что в присутствии активных шаперонов Hsp70 сворачивание синтезируемой люциферазы также замедлится, и будет происходить с длительной пост-трансляционной фазой. Для проверки этого предположения трансляцию люциферазной мРНК проводили в присутствии люциферина, непрерывно регистрируя активность синтезируемого фермента. После появления люциферазной активности в реакционную смесь добавляли ингибитор трансляции. Нарастание свечения после остановки синтеза белка было бы возможно лишь вследствие пост-трансляционного сворачивания.

На рис. 4 видно, что введение миноциклина (антибиотика тетрациклинового ряда) в систему трансляции приводило к немедленному прекращению накопления в ней активного фермента. Никакого нарастания свечения вследствие пост-трансляционного сворачивания обнаружено не было ни в системе трансляции с добавленными шаперонами, ни в системе без экзогенных шаперонов, в которой активность Hsp70 практически отсутствует.

В контрольном опыте (рис. 4в) добавление буферного раствора вместо ингибитора вызывало лишь незначительное замедление накопления активной люциферазы из-за разбавления смеси. Таким образом, добавление в систему трансляции активных экзогенных Hsp70 не приводит к увеличению длительности пост-трансляционной фазы сворачивания синтезируемого белка, что указывает на неучастие Hsp70 в котрансляционном сворачивании люциферазы.

Рис.4 Оценка длительности пост-трансляционной фазы сворачивания люциферазы, синтезируемой в присутствии шаперонов Hsp70. Синтез белка проводили в бесклеточной системе трансляции без добавления шаперонов (а) или с шаперонами, добавленными до концентрации 1.3 мкМ, 200 нМ и 650 нМ, соответственно (б). Объём реакционной смеси составлял 25 мкл. В момент, отмеченный стрелкой, в систему вводили 0.5 мкл раствора миноциклина с концентрацией 5 мМ. (в) В контрольном эксперименте в систему добавляли 0.5 мкл буферного раствора.

Глава III. Сворачивание люциферазы с иммобилизованным на массивной частице С концом Наблюдаемые различия между котрансляционным сворачиванием и ренатурацией люциферазы в скорости и эффективности этих процессов должны определяться физико-химическими факторами. Например, при ренатурации развёрнутого полноразмерного белка оба конца его цепи подвижны и не закреплены, в то время как С конец синтезируемого полипептида закреплён на рибосоме, масса которой на порядки превышает массу растущей полипептидной цепи. Для проверки предположения о том, что иммобилизация С конца полипептида может служить причиной его быстрого и эффективного сворачивания из развёрнутого состояния, использовали два подхода. Первый заключался в иммобилизации С конца люциферазы на гранулах хроматографического носителя, второй – в использовании природных комплексов рибосомы с растущим полипептидом, связанным с рибосомой в виде пептидил-тРНК.

3.1. Сворачивание полипептидной цепи люциферазы, иммобилизованной на гранулах сефарозы Иммобилизацию С конца полипептидной цепи на массивной частице проводили, используя высокое сродство олигогистидинового тракта к ионами никеля, связанным на поверхности гранул хелирующей сефарозы. Для получения люциферазы, содержащей С-концевой гексагистидиновый тракт, к 3’ концу люциферазного гена была добавлена нуклеотидная последовательность, кодирующая дополнительный 22-членный пептид, оканчивающийся шестью гистидиновыми остатками. Такой ген экспрессировали в клетках E. coli и синтезированный активный фермент выделяли из клеток и очищали с помощью металл-хелатной хроматографии.

Связанный с никелевой сефарозой белок денатурировали в буферном растворе 7 М мочевины при 25°C в течение 5 минут. Для инициации сворачивания образец при той же температуре разбавляли буферным раствором без денатуранта, содержащим АТФ и люциферин. Конечная концентрация люциферазы составляла 8 нМ. За ренатурацией следили по восстановлению светоизлучающей активности в реакционной смеси, помещённой в ячейку люминометра.

Рис.5 Сворачивание денатурированной люциферазы, иммобилизованной на гранулах Ni2+-сефарозы (на носителе) и свободно диффундирующей в растворе. (а) Непрерывная регистрация люминесценции ренатурирующей люциферазы. Контролем служило разбавление неденатурированной люциферазы буферным раствором с АТФ и люциферином. (б) Измерение активности фермента в аликвотах, отобранных из реакционной смеси в указанное время. За 100% принята активность неденатурированной люциферазы.

Оказалось, что иммобилизация С конца белка не ускоряет его ренатурации: уровень плато не был достигнут за 25 минут инкубации (рис. 5а).

В то же время иммобилизованный на носителе белок сворачивался с существенно большим выходом, чем белок, ренатурирующий в свободном виде в растворе.

Измерение активности фермента в аликвотах, отобранных из реакционной смеси, позволило определить выход активного белка в процессе ренатурации.

На рис. 5б видно, что приблизительно 20% иммобилизованных на носителе молекул белка восстанавливает свою активность. В то же время плато выхода ренатурации свободного белка в растворе достигает значения всего в 5%. При этом характеристическое время восстановления половины от максимально достижимой активности составляет 50 минут как для ренатурации фермента в растворе, так и на носителе. Можно заключить, что иммобилизация С конца люциферазы на гранулах сефарозы увеличивает эффективность ренатурации, но не влияет на скорость этого процесса.

Причина низкой продуктивности ренатурации люциферазы в растворе может заключаться либо в неправильном сворачивании отдельных молекул белка, либо в их агрегации. В отличие от первой, вторая реакция зависит от концентрации белка. В следующей серии опытов ренатурацию проводили при разной концентрации люциферазы, составлявшей после разбавления денатуранта 0.33, 1.6, 8, 32 и 160 нМ. Результат опыта представлен на рис. 6.

Видно, что эффективность ренатурации люциферазы в растворе снижается при увеличении концентрации белка.

Рис.6 Ренатурация находящейся в растворе (а) и иммобилизованной (б) полипептидной цепи люциферазы при разной концентрации белка. Концентрация люциферазы составляла 0.33 (1, ), 1.6 (2, ), 8 (3, ), 32 (4, ) и 160 (5, ) нМ.

Так, при концентрации 0.33 нМ выход активного фермента составляет 30%, а при 160 нМ – всего лишь 0.5% (рис. 6а, кривые 1 и 5). Очевидно, что основной причиной низкого выхода активной люциферазы при ренатурации в растворе является её межмолекулярная агрегация. Такой же опыт был проведён с белком, иммобилизованным на гранулах сефарозы (рис. 6б). Видно, что в отличие от ренатурации в растворе, эффективность ренатурации полипептидных цепей, связанных с носителем, не зависит от концентрации фермента и составляет при всех использованных концентрациях белка примерно 20%. Следовательно, можно заключить, что иммобилизация белка на носителе исключает его агрегацию и, тем самым, способствует его эффективному сворачиванию.

3.2. Ренатурация люциферазы, иммобилизованной на рибосоме в виде пептидил-тРНК Для получения рибосом, содержащих пептидил-тРНК с пептидом заданной длины, применяли "останавливающую" последовательность белка SecM. Эту последовательность составляют аминокислотные остатки со 150 по 166.

Известно, что после синтеза этого 17-членного участка полипептидной цепи рибосомой трансляция останавливается и дальнейшего удлинения полипептида не происходит. При этом синтезированная полипептидная цепь остаётся прочно связанной с рибосомой в виде пептидил-тРНК, находящейся в Р-участке.

Для получения люциферазы, иммобилизованной на 70S рибосоме, к 3’ концу кодирующей части люциферазного гена была добавлена последовательность, кодирующая 13-членный спейсерный участок и "останавливающий" фрагмент SecM длиной в 17 аминокислотных остатков (рис. 7а). Поскольку связанной с рибосомой люциферазе необходимо не менее 26 дополнительных C-концевых аминокислотных остатков для сворачивания в энзиматически активный белок, наличие спейсера было необходимо для проявления активности "остановленной" люциферазы. Кроме этого, на 5’ конец гена люциферазы поместили последовательность, кодирующую гексагистидиновый тракт.

Ген модифицированной люциферазы, находящийся под контролем Т7промотора, вводили в клетки E. coli штамма BL21(DE3). Образовавшиеся в результате его экспрессии комплексы рибосомы с энзиматически активной люциферазой выделяли из клеток и подвергали хроматографической очистке на хелирующем носителе. На рис. 7б представлен результат электрофоретического анализа белкового состава комплексов. Видно, что кроме полос рибосомных белков, на геле присутствует дополнительная полоса с электрофоретической подвижностью, соответствующей подвижности белка с массой в ~100 кДа. Это значение соответствует ожидаемой молекулярной массе люциферазной пептидил-тРНК. При обработке комплексов пуромицином (антибиотиком, реагирующим с пептидил-тРНК в Р-участке и вызывающим освобождение полипептида из рибосомы) изменяется электрофоретическая подвижность только этого компонента комплексов. После пуромициновой реакции подвижность уменьшается до значения, соответствующего белку с молекулярной массой в ~70 кДа, т.е. модифицированной люциферазе. Это доказывает, что люцифераза была связана с рибосомой в виде пептидил-тРНК, находящейся в Р-участке.

Рис.7 Получение люциферазы, связанной с рибосомой в виде пептидил-тРНК.

(а) Вверху: схема ДНК-матрицы, кодирующей модифицированную люциферазу. Ген белка находится под контролем Т7-промотора (Т7), последовательность люциферазы не содержит терминирующего кодона (LUC(-stop)). Дополнительные последовательности кодируют N-концевой гексагистидиновый тракт (His-tag) и Cконцевой "останавливающий" фрагмент белка SecM (SecM), соединённый с люциферазой 13-членным пептидом (спейсер). Внизу: схема комплекса рибосомы и люциферазной пептидил-тРНК, образующейся при экспрессии гена модифицированной люциферазы. (б) Электрофоретический анализ белкового состава рибосомных комплексов, содержащих люциферазную пептидил-тРНК.

Анализировали вакантные рибосомы E. coli (1), комплексы, полученные после хроматографической очистки на хелирующей сефарозе (2) и такие же комплексы после реакции с 2 мМ пуромицином (3). Представлена фотография геля, окрашенного кумасси голубым. Положение маркеров молекулярной массы и величины их масс указаны слева от электрофореграммы. Положение люциферазной пептидил-тРНК и люциферазы указано стрелками справа.

Для изучения ренатурации белка, связанного с рибосомой, нельзя применять денатурацию в концентрированном растворе мочевины, поскольку это приведёт к разворачиванию рибосомы и разрушению её комплекса с пептидил-тРНК. Известно, что люцифераза светлячка является термолабильным белком, инактивирующимся при повышенной температуре.

Термоинактивацию применили для денатурации люциферазы, связанной с рибосомой. Предварительно нами было установлено, что после 20 минут инкубации при 40°С люцифераза полностью теряла активность, но оставалась связанной с рибосомой в виде пептидил-тРНК, чувствительной к пуромицину.

Для инициации сворачивания люциферазы, денатурированной нагреванием при 40°С, образец возвращали к нормальной температуре в 25°С.

За ходом ренатурации следили по восстановлению светоизлучающей активности фермента. В качестве контроля использовали белок, который не подвергался тепловой инактивации.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»