WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

- маркеры пролиферативной активности - PCNA, Ki67, циклин D1, Ki-67(MIB.1) Dako 1:121°,рН 6.моноклональные цитратный буфер рецепторы эпидермального фактора роста HER2/neu, EGFR, P53(D07) Dako 1:121°,рН6.моноклональные цитратный буфер рецепторы стероидных гормонов - эстрогеновые ER и Bcl2 Dako 1:12Г,рН6.моноклональные цитратный буфер прогестероновые PgR, Екадгерин Dako 1:121°,рН6.моноклональные цитратный буфер В-катенин Dako 1:- маркеры апоптоза Bcl2, BclX, CD95, 121°,рН6.моноклональные цитратный буфер Тенасцин Dako 1:30 Протеиназа К - супрессоры опухолевого роста - р53, р16, поликлональные EGFR Dako RTU Протеиназа К моноклональные - матриксные металлопротеиназы ММР-1, ММР-2, ММР-9 и их тканевые Коллаген IV Dako RTU Протеиназа К моноклональные ингибиторы TIMP-1 и TIMP-2, CD44 Dako 1:121°,рН6.моноклональные ] цитратный буфер Р16 Dako RTU 121°,рН6.- молекулы адгезии - Е-кадгерин, бета-катенин, CD44, моноклональные цитратный буфер сегЬВ2 Dako 1:200 121°,рН6.поликлональные цитратный буфер - компоненты внеклеточного матрикса - тенасцин, коллаген IV типа, Ламинин Dako 1:121",рН6.поликлональные цитратный буфер ламинин, Циклин D1 Pick Cell 1:200 121°,рН6.моноклональные Laboratories цитратный буфер - новые маркеры опухолувого роста - протимозин альфа, BclX NovoCastra 1:50 Протеиназа К моноклональные протеинкиназа MAKV/HUNK, танкираза 2. ММР1 NovoCastra 1:121°,рН 6.моноклональные цитратный буфер ММР2 NovoCastra 1:40 121°,рН 6.Условия проведения реакций (метод восстановления антигенной моноклональные цитратный буфер ММР9 NovoCastra 1:20 Без обработки активности и использованные разведения антител) представлены в таблице моноклональные NovoCastra TIMP1 1:20 121°, рН8.0ЭДТА (Таблица 6).

моноклональные буфер TIMP2 NovoCastra 1:121°, рНв.ОЭДТА моноклональные буфер Таблица 6. Использованные антитела.

CD95 NovoCastra 1:10 121°, рН8.0 ЭДТА моноклональные буфер Наименование Фирма Разведение Условия Протимозин а Ин-т им. 1:150 Без обработки демаскировки производитель моноклональные Белозерского МГУ 1:35 121°,рН 6.ER Dako н моноклинальные цитратный буфер Протеинкиназа Институт биологии 50нг/мл Без обработки 1:50 121°,рН6.Dako PgR MAKV/HANK гена цитратный буфер моноклональные моноклональные 1:200 121°,рН6.PCNA Dako Танкираза 2 Ин-т им. 1:50 рНб.О моноклональные цитратный буфер Моноклональные | Белозерского МГУ выражая полученные результаты в процентах. Маркеры пролиферативной Материал для исследования методами иммуногистохимии и гибридизации in активности расценивались на основе наиболее часто употребляющегося situ фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 24 ч., заливали в способа оценки пролиферативной активности:

парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на 1) 0% - 20% - низкая пролиферативная активность, высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 2) 21% - 50% - умеренная пролиферативная активность, часов. Восстановление антигенной активности проводили в миниавтоклаве 3) 51% -100% - высокая пролиферативная активность «2100Retrieval» («Pick Cell») при температуре 121°С в течение 20 мин. и Для количественной оценки площади ткани опухоли, содержащей последующим остывании 90 мин. Восстановление проводили в цитратном тенасцин, нами была разработана методика с использованием анализатора буфере рН 6,0 или в ЭДТА-буфере рН 8,0, для некоторых антител изображения и модифицированной компьютерной программы.

использовалась протеазная обработка (Таблица 6). В качестве детекционной Всего было оценено более 5000 препаратов с иммуногистохимическими системы применяли систему «EnVision» («Dako»), в качестве хромогена реакциями.

диаминобензидин и АЕС. Для получения результатов пригодных для Метод in situ гибридизации количественной обработки реакции проводили с помощью автоматического Были использованы два варианта метода гибридизации in situ иммуногистостейнера «Avtosteiner Dako».

флуоресцентная и хромогенная in situ гибридизация на парафиновых срезах.

Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме ( ММР, TIMP) и на Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) применялся для мембранах клеток (молекулы адгезии) оценивали полуколичественным определения амплификации гена HER2/neu при исследовании рака молочной способом по балльной шкале от 0 до 3 с помощью анализатора изображения железы и уротелиального рака. Срезы получали с тех же парафиновых блоков, «Leica Q550», учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 - которые использовались для иммуногистохимического исследования, и перед отсутствие реакции, 1 - слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - сильная проведением исследования высушивали при температуре 560С в течение реакция. При оценке реакции с антителами к HER2/neu и EGFR использовали часов. Если при оценке экспрессии белка HER2/neu получали результат 2+ по общепринятую для фармакодиагностики шкалу оценки от 0 до 3+ (Jacobs T.W. трехбалльной шкале, то с помощью наборов для флуоресцентной etal., 1999). гибридизации фирм «Dako» и «Vysis (Abbott)» и использованием автоматического гибридайзера «Hybridazer Dako» определяли наличие Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию амплификации гена HER2/neu. После соответствующих операций по подготовке (PCNA, Ki67, р53, bcl2, рецепторы эстрогенов и прогестеронов и др.) оценивали, срезов денатурацию проводили при температуре 82°С («Dako») или 95°С подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения и («Vysis»), гибридизацию - при 45°C(«Dako») или 37°C(«Vysis») в течение Материал фиксировали 10% формалином в течение 24 часов и заливали часов. Результаты оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа в парафин. ИГХ исследования проводили на срезах толщиной 4 мкм, используя «Axioscop 40» («Zeiss») с телекамерой «Axiocam» с использованием двойного антитела к тенасцину (DAKO) и детектирующую систему EnVision. Реакцию фильтра для красителей FITC и Texas Red: подсчитывали количество зеленых проводили в стандартных условиях в иммуногистостейнере Avtostainer DAKO.

меток, связанных с центромерным участком 17 хромосомы и количество Полученные препараты докрашивали гематоксилином.

красных меток, связанных с геном HER2/neu. Наличие или отсутствие Для получения цветного изображения использовали световой микроскоп амплификации определяли по соотношению к расных (ген HER2) и зеленых LEICA DMRB, сопряженный с телекамерой ProgRes 3012 и компьютером.

сигналов (центромерный участок), амплификация считалась обнаруженной при Изображения захватывались при увеличении хЮО, что соответствовало соотношении больше чем 2,2.

размеру поля зрения 1,28x0,98 мм2 при разрешении 1440x1100 пикселей. С Метод хромогенной гибридизации in situ (CISH) использовали для каждого микропрепарата захватывалось по 3 наиболее репрезентативных поля определения наличия ДНК вируса папилломы человека в клетках зрения. Все изображения захватывались с одинаковыми настройками плоскоклеточного рака шейки матки и уротелиального рака. Использовали микроскопа, телекамеры и балансировки белого цвета, что позволяет детекционные наборы «Микровирус ВПЧ» (Экспериментальное медикопроводить последующее сравнение изображений. Цветовые и контрастные биологическое производство Кардиологического научно-производственного расхождения между компьютерным изображением и визуальной картиной центра, Россия) и «Rembrandt HPV»(PathPan, Нидерланды). Исследование участка микропрепарата были минимальными.

проводили так же с использованием автоматического гибридайзера. После Перед определением площадей, занимаемыми элементами изображения ферментативной предобработки парафиновых срезов раствором пепсина или необходимо искусственно провести между ними четкие границы. Это было протеиназы Ки нанесения зондов к ВПЧ разных типов (общему, 6,11, 16, 18, 31, сделано с использованием инструментов программы Adobe Photoshop 7,0 с 33) денатурацию ДНК проводили при 95°С, а гибридизацию - при 37°С в последующей ручной корректировкой. Для этого изображение открывалось в течение 16-18 часов. В качестве хромогена использовали краситель АЕС.

программе A dobe Р hotoshop и дублировалось в дополнительный слой. Все Реакцию оценивали с помощью анализатора изображения «Leica Q550IW».

дальнейшие процедуры п роводились на дополнительных слоях. Результаты каждого ш ага обработки сохранялись в своем слое, что позволяло вносить Метод автоматизированной количественной оценки экспрессии корректировку в сложных случаях. Исходное изображение (слой «Bakground») тенасцина.

служило для визуальной оценки правильности последующей разметки Интенсивность экспрессии тенасцина оценивали путем измерения площади среза, занятой положительной реакцией с антителами к тенасцину.

препарата. Далее осуществлялись следующие последовательные шаги компонентов изображения проверяется визуально по исходному изображению обработки изображения:

при изменении в панели "Layers" прозрачности (Opacity) рабочего слоя, либо 1. регулировка яркостно-контрастных параметров, позволяющая после добавления выделения из а-канала.

визуализировать слабую реакцию и, по возможности, удалить фон, Результирующий файл содержит всю информацию о процессе обработки 2. сдвиг цветов изображения для повышения цветового контраста изображения, что позволяет оперативно возвращаться к любому этапу для изображения и облегчения визуального выделения участков со эффективной корректировки.

слабой окраской белка, С использованием этого метода была определена площадь с 3. размывание изображения для получения более равномерной окраски положительной реакцией к тенасцину во всех группах опухолей молочной участков ткани, содержащих тенасцин, железы и легкого.

4. использование маски нерезкости для подчеркивания гр аниц между Статистическая обработка результатов различно окрашенными участками опухоли, Статистический анализ проводили с использованием программы Excel с 5. выделение всех участков изображения без реакции, пакетом анализа данных по методам, описанным в книге «Статистические 6. инвертация выделения: выделенными оказываются структуры, методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel» содержащие тенасцин, (Лапач С.Н., Чубенко А.В.. Бабич П.Н., 2000г.). Применяли также 7. контроль точности выделения на исходном изображении (слой корреляционный анализ по Пирсону. При анализе корреляции Background).

метастазирования с экспрессией антигенов считали ее незначимой при 8. сохранение окончательного выделения в а-канале, значении модуля коэфиициента корреляции от 0 до 0,3; значимой - от 0,3 до 9. создание пустого слоя: инструментом Edit\Fill закрашиваем выделение 0,75 и высокой - выше 0,75.

красным цветом, инвертируем выделение и инструментом Edit/Fill закрашиваем его голубым цветом.

Таким образом, получено изображение, где все структуры, содержащие тенасцин, закрашены красным цветом, не содержащие - голубым; при этом отсутствует оптическая гетерогенность внутри соответствующих областей изображения. Граница между структурами четкая, структуры однозначно определяются программами анализа изображений. Правильность выделения РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ группах.Экспрессия рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR, ОБСУЖДЕНИЕ Изучение панели иммуногистохимических маркеров в раках легкого трех гистологических типов - плоскоклеточного, аденоплоскоклеточного и аденогенного выявило, что при плоскоклеточном раке (Рис.1) в группе с метастазами отмечается достоверное увеличение пролиферативной активности:экспрессия PCNA в среднем составляет 68%, Ki-67 - 46,5%, в тоже время в группе N0 эти значения существенно ниже - PCNA - 55% и Ki-67 - 28%.

Более половины образцов группы N+ имели значения PCNA выше 50%.

Значительно усиливалась экспрессия циклина D1: с 9 до 21,8%. Образцы с экспрессией р53 отмечены в обеих группах, но в группе с метастазами она увеличена до 42%. Экспрессия р16 в обеих группах имела неоднородный характер, хотя число образцов с положительной реакцией в группе N+ HER2/neu) также была низкой в обеих группах. Наиболее резкие отличия по возрастало. Ингибитор апоптоза Ьс!2 имел низкую экспрессию в обеих Экспрессия основных молекул адгезии Е-кадгерина и бета-катенина в группе с метастазами значительно снижена и не имеет интенсивной экспрессии (3+) на мембранах клеток. В этой группе отмечено появление цитоплазматической и ядерной реакции с бета-катенином, что указывает на нарушения в Wnt-сигнальном пути. В то же время на рис.2 хорошо видно, что если группа с метастазами довольно однородна, то в группе без метастазов отмечены образцы со значительным снижением экспрессии Е-кадгерина и бетакатенина (Рис. 2). В части этих образцов отмечена и усиленная экспрессия ММР2 и ММР9. В тоже время экспрессия неспецифической молекулы адгезии СД44 в клетках метастазирующих опухолей увеличивается, при сохранении ее уровня во внеклеточном матриксе (Рис.3). Определение количества тенасцина в образцах опухолей показало его достоверное увеличение в группе с иммуногистохимическому профилю выявлены в экспрессии ММР-2 и ММР-9: в группе с метастазами их интенсивная экспрессия отмечена в большинстве образцов. Экспрессия TIMP-2 достоверно снижается в группе N+. В группе без метастазов были отмечены случаи высокой экспрессией одной или нескольких исследуемых протеаз. Надо отметить, что во многих случаях наиболее интенсивная реакция с ММР наблюдалась по периферии опухолевого комплекса, что указывает на выход протеаз из клеток опухоли в внеклеточный матрикс, что ведет к его деградации и метастазированию опухоли. Экспрессия ММР1 и TIMP1 в обеих группах практически не отличается.

метастазами (Рис.4). Анализируя эту панель антител в аденоплоскоклеточном и аденогенном раках можно отметить, как сходные тенденции, так и различия (Рис.5) Показатель пролиферативной активности PCNA, как и для плоскоклеточного рака увеличивается в группе с метастазами, еще более (Рис.5) В аденогенном раке усиливаются тенденции, отмеченные для существенной становится разница по экспрессии циклина Д1 и появляется увеличение положительных случаев с экспрессией р16. Значимым параметром для аденоплоскоклеточного рака становится экспрессия EGFR, что связано с появлением аденогенной диференцировки. Для экспрессии молекул адгезии можно отметить изменения сходные с группой плоскоклеточного рака снижение экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина в группе с метастазами (Рис.6, 7). Уровень ММР2 и ММР9 в группе с метастазами также увеличивается.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»