WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Эксперименты выявили влияние фазы роста культуры на соотношение субпопуляций фенотипически различающихся клеток после устранения индуцирующих факторов. Если культура в момент устранения индуцирующих факторов находилась в стационарной фазе роста, то на всех чашках при посеве присутствовали как белые, так и синие клетки (синие клетки на чашке 0ч находятся в секторных колониях). Клетки, способные давать начало секторным колониям, исчезают из популяции лишь спустя 6 часов роста в жидкой среде в отсутствие индукторов, значит, все это время в популяции присутствуют клетки с неустойчивым эпигенотипом. Если культура в момент устранения индуцирующих факторов находилась в экспоненциальной фазе роста, то синие колонии появляются наряду с секторными и белыми уже на чашке 0ч. В результате дальнейшего роста в жидкой среде без индукторов, до 100% клеток приобретает эпигенотип lacI0cI1. Эти данные показывают, что на соотношение субпопуляций после устранения действия индукторов влияет не только фаза роста культуры, но и последующие условия роста. Рост в жидкой среде после устранения воздействия температуры 42оС и ИПТГ на культуру, находящуюся в экспоненциальной фазе роста, приводит к тому, что через 4 часа клетки переходят в практически однородную популяцию с эпигенотипом lacI0cI1. А при высеве клеток, той же культуры на агаризованную среду без индукторов образуется две субпопуляции клеток: lacI1cI0 и lacI0cI1.

Зависимость соотношения фенотипов клеток от фазы роста культуры на момент устранения действия индукторов Было исследовано, как время экспоненциального роста в присутствии ИПТГ при 42оС, после пересева клеток из 16 часовой культуры с теми же условиями, влияет на соотношение эпигенотипов клеток в популяции при последующем росте в жидкой культуре в отсутствие индуцирующих факторов. Клетки часовой культуры (42оС, ИПТГ) отмывали и разводили свежей средой с ИПТГ.

Далее культура росла экспоненциально 35, 70, 105 или 140 мин при температуре 42оС. Клетки каждого варианта переносили в среду без ИПТГ и 6 часов поддерживали экспоненциальный рост при 30оС. Через 6 часов клетки высевали на чашки (ИПТГ, 30оС). Результаты представлены на рис. 8. Эксперименты показали, что чем больше делений проходит после пересева клеток из 16 часовой культуры в свежую среду в присутствии двух индуцирующих факторов, тем больше клеток с эпигенотипом lacI0cI1 окажется в популяции через 6 часов роста в жидкой среде после устранения индукторов.

При пересеве клеток стационарной фазы в свежую среду, метаболизм клетки активизируется и после непродолжительной лаг-фазы начинается экспоненциальный рост. При этом клетка претерпевает столь разнообразные изменения, что синхронность процессов в разных клетках невозможна и, в результате, концентрации белков существенно варьируют от клетки к клетке. Это приводит к различному соотношению регуляторных белков CI и LacI в каждой отдельной клетке. Полученные нами результаты позволяют предположить, что эпигенетические системы (в частности ЦДС(-)) могут обеспечивать фенотипическое разнообразие в генетически однородной популяции, закрепляя флуктуации в количестве регуляторных белков, вызванные изменениями условий существования клетки.

42оС с ИПТГ 42оС с ИПТГ стационарная Экспоненциальный рост фаза 70 105 0 Время (мин) 30оС без ИПТГ Экспоненциальный рост Рис. 8. Зависимость между соотношением белых и синих колоний JC158 (pCIK3) и временем культивирования в свежей среде с ИПТГ при 42оС.

Клетки 16 часовой культуры (42 оС, ИПТГ) пересевали в свежую среду с ИПТГ и культивировали при 42 оС от 0 до 140 мин. Затем клетки были пересеяны в свежую среду без ИПТГ (30оС) и спустя 6 часов посеяны на чашки. - синие колонии, - белые колонии.

Заключение В присутствии двух индуцирующих факторов (42oC и ИПТГ) циклическая дигенная система с отрицательными обратными связями (ЦДС(-)), состоящая из блоков PL lacI и Ptrc cI, обеспечивает одновременный синтез репрессоров LacI и CI. Устранение индуцирующих факторов приводит к появлению в культуре двух субпопуляций клеток с разным уровнем синтеза -галактозидазы, что свидетельствует о прохождении ЦДС(-) метастабильного состояния, из которого циклическая система может перейти в каждый из двух устойчивых эпигенотипов - lacI1cI0 и lacI0cI1. Существование метастабильного состояния наглядно демонстрируется секторными колониями, являющимися результатом появления дочерних клеток, детерминированных к разным фенотипам за счет флуктуаций количества регуляторных белков при делении клетки. Секторные колонии можно наблюдать не только при посеве культуры, подвергшейся одновременному воздействию двух индуцирующих факторов, но и при посеве культуры, индуцированной к переключению в альтернативный эпигенотип. Следовательно, клетка, содержащая ЦДС(-), в процессе переключения из одного эпигенотипа в другой проходит метастабильное состояние. Перевести клетки в метастабильное состояние можно и без воздействия специфических индуцирующих факторов - изменением скорости роста культуры, что также приводит к изменению соотношения белков-репрессоров, кодируемых ЦДС(-). В результате фенотипически однородные клетки при последующем пересеве в свежую среду образуют фенотипически различающиеся дочерние клетки.

Таким образом, во всех случаях возникновение гетерогенности популяции связано со стохастическими процессами, приводящими к несколько различающимся концентрациям белков-репрессоров в отдельных клетках, и с флуктуациями в распределении белков при делении клетки, находящейся в метастабильном состоянии. Соотношение численности субпопуляций клеток определяется условиями роста культуры в момент перехода из метастабильного состояния в устойчивые эпигенотипы. Так, проведенные эксперименты показали, что при росте на агаризованной среде и при росте в жидкой культуре устанавливается разное соотношение субпопуляций, кроме того, соотношение зависит от фазы роста культуры в момент устранения индукторов.

Введение в клетку, содержащую ЦДС(-), циклической моногенной системы с отрицательной обратной связью приводит к изменению как базального, так и максимального уровня репрессоров LacI и CI в клетке, что поддерживает фенотипическую гетерогенность, увеличивая частоту спонтанных переключений.

Выводы 1. Расщепление популяции клеток E.coli, содержащих циклическую дигенную систему с отрицательными обратными связями (ЦДС(-)), на две фенотипически различающихся субпопуляции индуцируется одновременным воздействием двух специфических индуцирующих факторов или непродолжительным воздействием одного, а также изменением скорости роста культуры.

2. Возникновение двух субпопуляций в потомстве одной клетки E.coli, содержащей ЦДС(-), является результатом перехода циклической системы в метастабильное состояние в присутствии двух репрессоров.

3. На соотношение субпопуляций влияют фаза роста культуры E.coli в момент перехода клеток в метастабильное состояние и последующие условия роста.

4. Так как две субпопуляции появляются в отсутствии внешнего воздействия, то этот процесс является экспериментальной моделью одного из возможных молекулярных механизмов детерминации клеток к самодифференцировке.

5. Введение в клетку E.coli, содержащую циклическую дигенную систему, циклической моногенной системы, обеспечивающей стабильный уровень одного из белков-репрессоров, изменяет соотношение репрессоров, во всех эпигенотипах и поддерживает фенотипическую гетерогенность культуры.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Ступак И.В., Ступак Е.Э., Чураев Р.Н. Анализ функциональных состояний векторной эпигенной конструкции. // Материалы 3 съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. – Москва, 2004. – С. 411.

2. Ступак Е.Э., Ступак И.В. Влияние особенностей синтеза репрессора на уровень экспрессии контролируемого им гена в периодической культуре E. coli // Биология – наука ХХІ века. 9 Международная Пущинская школаконференция молодых ученых. Сб. тезисов. – Пущино, 2005. – С. 55.

3. Ступак Е.Э., Ступак И.В. Искусственные генетические триггеры // Материалы международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Т.1. – Минск, 2005. – С. 114.

4. Чураев Р.Н., Ступак Е.Э., Ступак И.В., Галимзянов А.В. Новое свойство эпигенов: метастабильные эпигенотипы // ДАН.–2006.–Т. 406, № 4.–С. 570-573.

5. Stupak E.E., Stupak I.V. Inheritance and state switching of genetic toggle switch in different culture growth phases // FEMS Microbiol Lett.– 2006.– V. 258.– P. 37–42.

6. Ступак Е.Э., Ступак И.В. Управление соотношением численности субпопуляций клеток E.coli, содержащих циклическую дигенную систему // Биология – наука ХХІ века. 10 Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сб. тезисов. – Пущино, 2006.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»