WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

lnD8000 JC158 –– JC158(pCIK3) - - 4000 ---0 -0 1 2 3 4 5 6 7 время, часы Рис. 4. Периодическая культура клеток JC158 и клеток JC158(pCIK3), с эпигенотипом lacI1cI0 в среде М9 с ацетатом натрия.

Кривые роста - тонкая линия, изменение активности -галактозидазы - жирная линия.

активность галактозидазы активность галактозидазы При периодическом культивировании на среде М9 с глюкозой клетки проб “0 – 5 часов” также дают начало белым колониям в 100%, а при рассеве пробы “6 часов” появляется 1% секторных колоний. Через 24 часа после начала эксперимента клетки периодической культуры образуют на чашках 95% белых и 5% синих и секторных колоний. В периодической культуре на среде М9 с ацетатом натрия уже через 2 часа после начала эксперимента появляются клетки, образующие на чашках синие (1%) и секторные колонии (5%). Через семь часов после начала эксперимента при посеве образуется 50±10% синих, 10±5% секторных и 40±10% белых колоний; через 24 часа – 70±10% синих, 5±2% секторных и 25±10% белых колоний.

Более низкие значения активности -галактозидазы в клетках штамма JC158(pCIK3) с эпигенотипом lacI0cI1, вероятнее всего, объясняются наличием в клетках некоторого количества репрессора LacI, причем, как следует из графиков изменения активности, при замедлении скорости роста культуры его содержание в клетке увеличивается. Однако, как показывают рассевы, содержание репрессора в клетке не достигает значений, достаточных для изменения эпигенотипа.

Изменения активности в клетках JC158(pCIK3) с эпигенотипом lacI1cI0 при росте на средах LB и М9 с глюкозой, в общем, соответствуют накоплению галактозидазы в клетках за счет активации транскрипции комплексом БАКцАМФ. Поэтому можно предположить, что в жидкой культуре практически все клетки фенотипически однородны. С другой стороны, при рассеве на чашки проб 6ч и 24ч появляются секторные и синие колонии. Следовательно, к этому времени, несмотря на фенотипическую однородность, в части клеток периодической культуры изменилось соотношение молекул белков-репрессоров.

Поскольку даже в клетках с эпигенотипом lacI0cI1 количество репрессора LacI в процессе роста периодической культуры увеличивается, то в данном случае соотношение белков изменяется за счет увеличения концентрации репрессора СI.

При периодическом культивировании клеток JC158(pCIK3) на среде М9 с ацетатом натрия к стационарной фазе активность -галактозидазы возрастает в 170 раз по сравнению с экспоненциальной фазой роста, что в 17 раз превышает ожидаемое значение. Объяснить данные результаты можно только тем, что медленный рост в среде М9 с ацетатом натрия приводит к появлению клеток с альтернативным фенотипом в процессе роста культуры.

Рассев клеток на чашки позволяет непосредственно увидеть процессы, происходящие в бактериальной популяции. Очень интересны в этом отношении секторные колонии. Фенотипически различающиеся сектора соответствуют разным субпопуляциям в потомстве одной клетки (Олескин и др., 2000). В наших экспериментах сектора колоний образованы клетками с разными эпигенотипами: синие участки колоний – lacI0cI1, белые участки – lacI1cI0.

Следовательно. к моменту посева на агаризованную среду в клетке установилось такое соотношение репрессоров, что в результате случайного распределения молекул и флуктуаций в концентрации белков при последующих делениях появились дочерние клетки, детерминированные к альтернативным эпигенотипам, т.е. клетка находилась в метастабильном состоянии (Tchuraev, 2006).

Наследование эпигенотипов клетками JC158(pCIK3/pLACI) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов В экспериментах была использована циклическая моногенная система с отрицательной обратной связью (ЦМС(-)), состоящая из гена lacI, помещенного под промотор лактозного оперона дикого типа (Plac), т.е. белок LacI негативно регулирует транскрипцию своего гена (рис. 1Б). По литературным данным известно, что ЦМС(-) образует авторегуляторную систему, предотвращающую сверхэкспрессию гена (Rosenfeld et al., 2002). В штамме JC158(pLACI) изменение скорости роста должно приводить к изменению скорости транскрипции как в лактозном опероне на хромосоме, так в ЦМС(-) на плазмиде.

Однако авторегуляция синтеза LacI в ЦМС(-), должна стабилизировать содержание репрессора в клетке. Для проведения последующих экспериментов в штамм JC158(pCIK) котрансформировали плазмиду pLACI. При этом в клетке образуется искусственная генетическая сеть, состоящая из циклической дигенной системы с отрицательной обратной связью и ЦМС(-).

Для клеток штаммов JC158(pLACI) и JC158(pCIK3/pLACI) был поставлен описанный выше эксперимент с использованием сред LB и М9 с глюкозой.

Было показано, что в штамме JC158(pLACI) уровень активности галактозидазы в процессе роста периодической культуры на этих средах увеличивается в линейной фазе роста в 3 раза по сравнению с экспоненциальной и вновь опускается в стационарной фазе. Следовательно, в данном случае репрессор, негативно регулирующий собственный синтез, стабилизирует содержание в клетке продукта, регулируемого им гена, даже в присутствии активатора транскрипции. В культуре JC158(pCIK3/pLACI), предварительно индуцированной к эпигенотипу lacI0cI1 активность галактозидазы колеблется около 170 ед. на среде LB и около 140 ед. на среде М9 с глюкозой. В культуре, предварительно индуцированной к эпигенотипу lacI1cI0 активность -галактозидазы возрастает от 2 до 15±5 ед. на среде LB и от 10±1 до 30±5 ед., с последующим снижением в стационарной фазе до 10 ед., на среде М9 с глюкозой. При рассеве клеток периодической культуры, ранее индуцированных к эпигенотипу lacI0cI1 на всех фазах роста на чашках наряду с синими колониями образовывалось 10±5% белых. При рассеве клеток периодической культуры, ранее индуцированных к эпигенотипу lacI1cI0 на всех фазах роста, на чашках образовывалось 45±20% синих, столько же белых и 10±5% секторных колоний.

Таким образом, в культуре JC158(pCIK3)(pLACI) при периодическом культивировании на всех фазах роста присутствуют клетки, детерминированные к альтернативным фенотипам. Вероятнее всего, последнее связано с увеличением частоты спонтанных переключений между эпигенотипами.

Изменение эпигенетического состава популяции клеток JC158(pCIK3) под действием индуцирующих факторов Можно предположить, что в результате флуктуаций в концентрации регуляторных белков, клетки будут переключаться под действием индуцирующих факторов из одного стабильного эпигенотипа в другой не одновременно. И, следовательно, при ограниченном времени воздействия индуцирующего фактора, популяция разделится на две субпопуляции.

Культуру подращивали 14-16 ч в условиях, необходимых для перевода клеток в эпигенотип lacI0cI1 или в эпигенотип lacI1cI0. Далее часть культуры переводили в экспоненциальную фазу, пересевом в свежую среду при тех же условиях на 2 часа. Затем клетки с эпигенотипом lacI0cI1 пересевались в среду без ИПТГ и росли при 42оС, а клетки с эпигенотипом lacI1cI0 пересевались в среду c ИПТГ и росли при 30оС. После пересева культуру поддерживали в экспоненциальной фазе. Клетки высевали на чашки из ночной культуры (чашка 0) и через 2, 4, 6 часов экспоненциального роста после пересева в свежую среду. На чашках колонии росли при 30оС без ИПТГ на протяжении 24 ч.

Были получены следующие результаты. При высеве на чашки клеток, находившихся в процессе переключения из lacI0cI1 в lacI1cI0, динамика изменения соотношения фенотипов колоний практически не зависела от фазы роста культуры, используемой для переключения (рис. 5).

A 30оС с ИПТГ 42оС без ИПТГ Стационарная Экспоненциальный рост фаза 0 2 Б 30оС с ИПТГ 42оС без ИПТГ Экспоненциаль Экспоненциальный рост ный рост 0 2 Время (ч) Рис. 5. Соотношение фенотипов колоний на чашке при переходе из эпигенотипа lacI0cI1 в эпигенотип lacI1cI0.

Клетки JC158 (pCIK3) были посеяны на чашки после указанного периода роста в жидкой культуре при 42оС без ИПТГ. Для переключения была использована культура в стационарной (А) или экспоненциальной фазе роста (Б). - синие, - секторные, - белые колонии.

Через два часа экспоненциального роста при 42оС без ИПТГ при посеве на чашки клетки образуют белые и секторные колонии (секторных 30±10%, при использовании для переключения культуры lacI0cI1 в стационарной фазе роста;

20±5% при использовании культуры в экспоненциальной фазе). Через четыре часа все колонии белые.

Динамика переключения клеток с эпигенотипом lacI1cI0 в lacI0cI1 (рис. 6) зависела от фазы роста культуры, используемой для переключения. Если клетки были инокулированы в свежую среду (30оС с ИПТГ) непосредственно из часовой культуры (42оС без ИПТГ), то через два часа экспоненциального роста при посеве на чашке образуются синие (20±5%), секторные (40±10%) и белые (40±10%) колонии; через четыре часа – секторные (5±2%) и синие (95±2%); через 6 часов роста – все колонии синие.

A 42оС без ИПТГ 30оС с ИПТГ Стационарная Экспоненциальный рост фаза 0 Б 42оС без ИПТГ 30оС с ИПТГ Экспоненциаль Экспоненциальный рост ный рост 0 2 Время (ч) Рис. 6. Соотношение фенотипов колоний на чашке при переходе из эпигенотипа lacI1cI0 в эпигенотип lacI0cI1.

Клетки культуры JC158 (pCIK3) были посеяны на чашки после указанного периода роста в жидкой культуре при 30оС с ИПТГ. Для переключения была использована культура в стационарной (А) или экспоненциальной фазе роста (Б). - синие, - секторные, - белые колонии.

Если клетки 16 часовой культуры (42оС без ИПТГ) разводили свежей средой и инкубировали 2 часа в тех же условиях (культура переходила в экспоненциальную фазу роста), а затем пересевали в среду с ИПТГ и инкубировали при 30оС, то уже через два часа роста в измененных условиях 99,5100% клеток при высеве на чашки образуют синие колонии.

Формирование на чашках, засеянных клетками JC158(pCIK3), культивировавшимися в присутствии индуцирующих факторов, колоний с разными фенотипами подтвердило предположение, что при переключении под действием индукторов существует период эпигенетической гетерогенности популяции клеток, содержащих ЦДС(-). Появление секторных колоний при высеве культуры в процессе переключения свидетельствует о том, что клетки при смене эпигенотипа проходят через метастабильное состояние. Кроме того, было выявлено, что динамика изменения численности субпопуляций и влияние на нее фазы роста культуры, зависит от направления переключения эпигенотипа.

Для того, чтобы после устранения действия ИПТГ на клетки с первоначальным эпигенотипом lacI1cI0 ген сI продолжал экспрессироваться, концентрация связанного с ИПТГ Lac-репрессора к этому моменту должна разбавиться в ряду клеточных делений до значений ниже пороговых. То, что на переключение всех клеток популяции из эпигенотипа lacI1cI0 в lacI0cI1 требуется больше времени при использовании культуры в стационарной фазе роста, свидетельствует о более высоком содержании репрессора LacI в части клеток, по сравнению с экспоненциальной фазой роста. Наряду с этим, 20% клеток стационарной фазы переключаются так же, как клетки экспоненциальной фазы роста. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в клетках стационарной фазы содержание Lac-репрессора существенно варьирует от клетки к клетке, что в свою очередь приводит к различиям в скорости переключения динамического эпигена в разных клетках. Исходя из этого можно отметить, что результаты данного эксперимента не только показали динамику изменения соотношения субпопуляций с разными эпигенотипами в процессе переключения, но и обнаружили, что ЦДС(-) может использоваться для тестирования изменений клеточного метаболизма. То, что на изменение эпигенотипа lacI0cI1 на lacI1cI0 под действием температуры 42оС практически не влияет фаза роста культуры (рис. 5), вероятно связано с механизмом данного переключения. Эпимутация в этом случае происходит в результате распада димеров температурочувствительного репрессора CI до мономеров и поэтому не зависит от концентрации белка CI в клетке. Таким образом, если время действия индуцирующего фактора недостаточно для полного переключения культуры, то популяция разделяется на две фенотипически различающихся субпопуляции, соответствующих эпигенотипам lacI0cI1 и lacI1cI0. Длительность периода эпигенетической гетерогенности популяции в процессе переключения из одного устойчивого эпигенотипа в другой, при воздействии индуцирующего фактора, определяется не только стохастическими процессами, но и характером индуктора.

Динамика перехода клеток, содержащих ЦДС(-) из метастабильного состояния в стабильные Для перевода клеток в метастабильное состояние выращивали культуру в среде с ИПТГ при 42оС 14-16 ч. При этом в клетке синтезируется как репрессор CI, так и репрессор LacI. Далее клетки экспоненциально росли в среде без ИПТГ при 30оС. Клетки высевали на чашки из 16 часовой культуры (чашка 0 ч) и затем каждые 2 часа после устранения индукторов (чашки 2ч, 4ч, 6ч). Были получены следующие результаты. Клетки 16 часовой культуры при посеве на чашки (0ч) дали начало секторным (15±5%) и белым (85±5%) колониям. Клетки, пересеянные в свежую среду без ИПТГ при 30оС, через два часа экспоненциального роста при посеве на чашки образовали 70±10% белых, 25±10% секторных и 5±2% синих колоний, через четыре часа 75±10% белых, 5±2% секторных и 20±10% синих, через 6 часов - 85±10% белых и 15±10% синих (рис. 7А). Этот же эксперимент был поставлен и в другом варианте. Культуру, с эпигенотипом lacI1cI1 сначала переводили в экспоненциальную фазу роста, пересевая 16 часовую культуру в свежую среду и 2 часа подращивая в тех же условиях и, лишь затем, пересевали клетки в среду без ИПТГ при 30оС. Эксперимент продолжали, как описано выше.

При посеве на чашки клеток культуры, экспоненциально растущей при 42оС в присутствии ИПТГ, образуются белые (70±10%), секторные (20±10%) и синие (10±5%) колонии. После пересева культуры в среду без индукторов через 2 часа роста при посеве на чашки 98±1% колоний синие, 1±0,5% белые, 1±0,5% секторные, через 4 часа и через 6 часов 99,5-100% колоний синие (рис. 7Б).

A 42оС с ИПТГ 30оС без ИПТГ Стационарная Экспоненциальный рост фаза 0 2 Б 42оС с ИПТГ 30оС без ИПТГ Экспоненциаль Экспоненциальный рост ный рост 0 2 Время (ч) Рис. 7. Соотношение фенотипов колоний на чашке при переходе из неустойчивого эпигенотипа lacI1cI1, через метастабильный эпигенотип lacI0cI0, в стабильные состояния.

Клетки JC158 (pCIK3) были посеяны на чашки после указанного периода роста в жидкой культуре при 30оС без ИПТГ. Для переключения была использована культура в стационарной (А) или экспоненциальной фазе роста (Б). - синие колонии, - секторные колонии, - белые колонии.

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»