WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Ступак Евгения Эдуардовна ИНДУКЦИЯ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ В ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИХ ИСКУССТВЕННЫЕ ЦИКЛИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ГЕНОВ 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА – 2006

Работа выполнена в лаборатории математической и молекулярной генетики Института биологии Уфимского научного центра РАН Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Чураев Рустэм Нурович Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович Кандидат биологических наук, доцент Бабынин Эдуард Викторович Ведущая организация Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Защита состоится «21» ноября 2006 г., в часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН.

Адрес: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан «» октября 2006 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.

2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Паттерн экспрессии генов определяет фенотип клетки. Наследуемые изменения уровней экспрессии генов в клетках лежат в основе таких процессов как: выбор между литическим и лизогенным путями развития у умеренных бактериофагов (Johnson et al., 1981); фазовые вариации у прокариот (van der Woude, Baumler, 2004; van der Woude, 2005); клеточная дифференцировка эукариот (Latham, 1999; Kepes, 2005). Исследование механизмов возникновения дифференциальной активности генов в индивидуальных клетках клональной популяции - одно из наиболее актуальных направлений современной биологии. В большинстве случаев наследуемые в клеточных поколениях, но обратимые изменения генной активности являются результатом взаимосвязанных генетических (транспозиции, инверсии) и эпигенетических факторов (структура хроматина, модификации ДНК и ДНКассоциированных белков, переключение уровня синтеза транскрипционных факторов в циклических системах генов). Причем обратимые перестройки последовательности ДНК контролируются регуляторными белками (van der Woude, Baumler, 2004).

Как было показано в ряде работ (Gardner et al., 2000; Tchuraev et al., 2000) циклические дигенные системы с отрицательными обратными связями (ЦДС(-)) могут поддерживать два альтернативных уровня экспрессии генов и, соответственно, два фенотипа клетки. В этом случае ЦДС(-) является динамическим эпигеном, в котором часть наследственной информации хранится, кодируется и передается потомству вне первичной структуры молекул ДНК генома (Чураев, 1975). Использование при конструировании хорошо охарактеризованных генетических элементов, простая структура и наличие обратных связей, стабилизирующих систему, делают искусственные ЦДС(-) удобным объектом для изучения основных закономерностей возникновения фенотипической гетерогенности в популяции генетически однородных клеток.

Цель работы – исследовать возможность индукции наследуемой эпигенетической гетерогенности в клональной популяции клеток Escherichia coli, содержащих искусственные циклические системы генов.

Задачи исследования:

1. Исследовать стабильность наследования каждого из альтернативных фенотипов клеток, содержащих циклические дигенные системы с отрицательными обратными связями в процессе роста периодической культуры.

2. Исследовать фенотипический состав популяции клеток, содержащих ЦДС(-) и циклическую моногенную систему с отрицательной обратной связью в процессе роста периодической культуры.

3. Проверить возможность расщепления клональной популяции клеток E.coli, содержащих ЦДС(-), на две фенотипически различающихся субпопуляции в отсутствие специфических индуцирующих факторов.

4. Поставить эксперимент по одновременному воздействию двух индуцирующих факторов на клетки, содержащие ЦДС(-), для проверки гипотезы о существовании метастабильного состояния.

5. Исследовать влияние метаболизма клетки в момент воздействия индукторов на соотношение альтернативных субпопуляций клеток в дальнейшем.

Научная новизна исследования. Обнаружена возможность переключения функциональных состояний ЦДС(-) изменением скорости роста культуры.

Впервые установлено, что клетка, содержащая динамический эпиген, может при делении образовать дочерние клетки, детерминированные к альтернативному фенотипу. Экспериментально показано новое свойство динамического эпигена:

возможность перехода в метастабильное состояние под воздействием внешних факторов. Впервые получена экспериментальная модель одного из молекулярных механизмов детерминации клеток к самодифференцировке.

Научно-практическая значимость работы. Исследование эпигенетических механизмов возникновения фенотипической гетерогенности в изначально гомогенной популяции создает основу для разработки систем управления клеточными процессами. В биотехнологии управление структурой популяции, т.е.

поддержание необходимых фенотипических разновидностей клеток в необходимых пропорциях, позволит контролировать скорость процесса и варьировать на разных этапах соотношение синтезируемых продуктов. Поскольку многие мультифакторные признаки с изменчивой пенетрантностью (частотой проявления признака), возможно, имеют эпигенетическую основу, понимание причин разного уровня экспрессии генов в генетически однородных клетках необходимо для достоверной интерпретации результатов генетического анализа.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2004), международной научной конференции «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, 2005), 9 и 10 Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2005, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объём диссертации. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 200 источников. Диссертация иллюстрирована 2 схемами, 14 графиками и 28 фотографиями.

Благодарности. Считаю своей приятной обязанностью выразить признательность моему научному руководителю д.б.н. проф Чураеву Р.Н., сотрудникам института биологии н.с. Ступак И.В., к.б.н. Галимзянову А.В., к.б.н.

Галимзяновой Н.Ф., к.б.н. Миграновой И.Г., м.н.с. Тропыниной Т.С.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. Исследования проводились на клетках E.coli штамма JC158 (Hfr P01, thi1, serA6, lacI22, relA1) (Murphy, Pembroke, 1995), трансформированных плазмидами pCIK3 и/или pLACI. Плазмида pCIK(предоставлена Дж. Коллинзом (J.J. Collins, Boston University, USA)) содержит ЦДС(-) (рис. 1А), плазмида pLACI - ЦМС(-) (рис. 1Б).

Методы исследования. Клетки культивировали в богатой среде LB или в минимальной среде М9 с казаминовыми кислотами и 40мМ источником углерода (глюкоза, ацетат натрия) с добавлением необходимых для поддержания плазмид антибиотиков, при 30оС или 42оС (Миллер, 1976).

Логарифмическую фазу роста поддерживали периодическими разведениями свежей средой, оптическая плотность культуры составляла 0.04-0.4 ед. при длине волны 600нм (D600). Рост клеток в периодической культуре исследовали на протяжении 24 часов, начиная с D600 = 0,04-0,08. Для индукции экспрессии с Plac-промотора использовали изопропил--D-тиогалактозид (ИПТГ) в концентрации 1мM. Бактериальные клетки синтезирующие -галактозидазу выявляли на чашках Петри со средой LB, содержащей 40 мкг/мл хромогенного субстрата X-Gal (Миллер, 1976). Активность -галактозидазы оценивали при помощи хромогенного субстрата о-нитрофенил--D-галактозида (ОНФГ) и вычисляли в условных единицах по следующей формуле: 1000*D400/(t*v*D600), где D400 - измеренные значения для реакционной смеси, D600 отражает плотность клеточной суспензии перед определением, t - время реакции в мин и v - объем пробы культуры, взятой для определения, в мл (Миллер, 1976).

Полученная величина пропорциональна увеличению количества о-нитрофенола в минуту на одну бактериальную клетку. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса (Харди, 1990). Трансформацию проводили по оригинальной методике, основанной на прописях, предложенных в работах Ханаана (1988) и Perbal (1988).

ИПТГ ИПТГ А Б Plac pLACI lacI gfpmut3 pCIKcI Ptrc PL lacI Plac хромосома lacZ Plac lacZ 42oC Рис. 1. Схемы искусственных генных сетей, используемых в работе.

А. Сеть, состоящая из циклической дигенной системы с отрицательными обратными связями, локализованной на плазмиде pCIK3 и маркерного гена lacZ на хромосоме. Б.

Циклическая моногенная система с отрицательной обратной связью, локализованная на плазмиде pLACI.

Статистический анализ. Статистическую обработку проводили в программе Microsoft Exel. На графиках приведены средние данные из серии однотипных экспериментов (не менее трех повторностей). Принадлежность данных, полученных в экспериментах серии, к одной генеральной совокупности проверяли по критерию 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Циклическая дигенная система с отрицательными обратными связями (ЦДС(-)), локализованная на плазмиде pCIK3 (рис. 1А), содержит ген lacI E.coli под контролем модифицированного промотора PL фага (Gardner et al., 2000) и ген cI857 термочувствительного репрессора бактериофага под контролем промотора Ptrc, являющегося синтетическим аналогом Plac. Эти гены кодируют регуляторные белки LacI и CI. Так как CI репрессирует PL промотор, а LacI репрессирует Ptrc промотор, ЦДС(-) может находиться в двух стабильных функциональных состояниях: в одном высокий уровень экспрессии гена сI и низкий уровень экспрессии гена lacI (эпигенотип lacI0cI1), в другом высокий уровень экспрессии гена lacI и низкий - гена cI (эпигенотип lacI1cI0). Система переключается между устойчивыми эпигенотипами внешними метаболическим (ИПТГ) и температурным (42оС) индукторами.

Клетки E. coli штамма JC158, синтезируют функционально неактивный репрессор лактозного оперона (LacI), поэтому в клетках JC158(pCIK3) репрессия гена LacZ происходит только за счет Lac-репрессора, синтезируемого с плазмиды: клетки с эпигенотипом lacI0cI1 образуют синие колонии, lacI1cI0 – белые. Рассевом клеток, находившихся под действием одного из индуцирующих факторов, на чашки с X-Gal без ИПТГ с последующей инкубацией при 30оС было показано: 1) приобретенный под действием индуцирующих факторов эпигенотип поддерживается в процессе роста колонии; 2) при экспоненциальном росте культуры в жидкой среде в отсутствие индуцирующих факторов, клетки стабильно поддерживают эпигенотип, приобретенный ранее.

Наследование эпигенотипов клетками JC158(pCIK3) в периодической культуре в отсутствие индуцирующих факторов При периодическом культивировании бактериальных клеток (культивирование в закрытой системе) скорость роста культуры после окончания экспоненциального роста постепенно уменьшается, снижаясь до нуля к стационарной фазе. Замедление скорости роста культуры приводит к увеличению в клетке концентрации как циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), так и белка-активатора катаболитных оперонов (БАК). Комплекс БАК-цАМФ активирует транскрипцию с lac-промотора дикого типа.

Следовательно, при периодическом культивировании активность галактозидазы будет постепенно возрастать. Присутствие в среде культивирования глюкозы снижает концентрацию цАМФ в клетке, что приводит к падению уровня транскрипции с лактозного промотора.

Был поставлен следующий эксперимент. Культура JC158 или JC158(pCIK3) росла 14-16 часов на одной из сред: LB, М9 с глюкозой или М9 с ацетатом натрия. Штамм JC158(pCIK3) культивировался или при 42оС, или в присутствии ИПТГ при 30оС, для перевода клеток в соответствующий эпигенотип. Затем клетками засевали свежую среду (50 мл) до D600 = 0,002.

Культура росла при 30оС. Образцы для измерения оптической плотности и активности -галактозидазы забирали каждый час, начиная с D600=0,04-0,08, на протяжении 7 часов и через 24 часа после первой пробы. Клетки культуры JC158(pCIK3) высевали каждый час на чашки Петри с X-Gal с последующей инкубацией при 30оС. Результаты показали, что активность -галактозидазы за исследованный период роста культуры в среде LB возрастает от 500±50 до 6400±500 ед. (рис. 2), в минимальной среде с глюкозой от 600±100 до 1800±ед. (рис. 3). В минимальной среде с ацетатом натрия от 3000±100 до 7100±ед. (рис. 4). В культуре JC158(pCIK3), предварительно индуцированной к эпигенотипу lacI0cI1, на средах LB и М9 с глюкозой в экспоненциальной фазе роста в промежутке D600 0,04 – 0,12 активность -галактозидазы практически совпадает со значениями для культуры JC158. В последующем скорость накопления фермента уменьшается и максимальные значения активности галактозидазы в среде LB – 4300±500 ед., в среде М9 с глюкозой – 800±200 ед.

При росте культуры JC158(pCIK3) в среде М9 с ацетатом натрия активность галактозидазы изменяется от 1000±100 до 2500±200 ед. Как показали рассевы клеток на чашки, эпигенотип lacI0cI1 стабильно поддерживается клетками на всем протяжении роста культуры. В культуре JC158(pCIK3), предварительно индуцированной к эпигенотипу lacI1cI0, активность -галактозидазы увеличивалась за время культивирования от 1 до 10±2 ед. на LB (рис. 2), до 6±ед. – на М9 с глюкозой (рис. 3) и до 170±30 ед. (рис. 4) – на среде М9 с ацетатом натрия.

8000 JC158 –– lnDJC158(pCIK3) - - 4000 ---0 -0 1 2 3 4 5 6 7 время, часы Рис. 2. Периодическая культура клеток JC158 и клеток JC158(pCIK3), с эпигенотипом lacI1cI0 в среде LB.

Кривые роста - тонкая линия, изменение активности -галактозидазы - жирная линия.

При рассеве первых шести проб клеток (0 часов – 5 часов эксперимента), культивировавшихся в среде LB, появляются только белые колонии, при рассеве клеток пробы “6 часов” – 1% секторных колоний (состоящих из синих и активность галактозидазы белых секторов), пробы “24 часа” – 30±5% белых, 35±5% синих и 35±5% секторных колоний.

8000 lnDJC158 –– JC158(pCIK3) - - 4000 ---0 -0 1 2 3 4 5 6 7 время, часы Рис. 3. Периодическая культура клеток JC158 и клеток JC158(pCIK3), с эпигенотипом lacI1cI0 в среде М9 с глюкозой.

Кривые роста - тонкая линия, изменение активности -галактозидазы - жирная линия.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»